سیتوژنتیک (Cytogenetics)
رسیدیم به ایستگاه بعدی اوژن تاک و موضع جذاب سیتوژنتیک و شاخه ای از علم با اهمیت و کاربرد خیلی زیاد در حیطه ژنتیک و علوم مرتبط
توی این قسمت از اوژن تاک به چندین سوال مهم جواب میدیم :
سیتوژنتیک دقیقا به چی میگن ؟
مراحل تهیه کاریوتایپ متافازی چی هستند ؟
چه اجزایی برای رشد سلول ها قبل از آنالیز کروموزوم ها استفاده میشن و هر کدوم چه اهمیتی دارن ؟
میتوژن ها چیستند و چه اهمیتی دارند ؟
گروهبندی کروموزومها از نظر محل قرارگیری سانترومر
هتروکروماتین چیست و چه نقش و انواعی داره ؟
الگوهای نواربندی چه انواعی دارند ؟
سیتوژنتیک دقیقا به چی میگن ؟
به مطالعه کروموزومها و تقسیم سلول سیتوژنتیک میگویند.
- کاریوتایپ، عکسی است که از کروموزمها در مرحله متافاز گرفته میشود و برای مطالعه ناهنجاریهای کروموزمی مورد استفاده قرار میگیرد.
- بدین منظور از سلولهای قادر به رشد و تقسیم سریع در محیط کشت مانند گلبولهای سفید (خصوصاً لنفوسیت T)، فیبروبلاست (از بیوپسی پوست)، سلولهای جنینی (از مایع آمنیون)، پرزهای کوریونی و سلولهای مغز استخوان استفاده میشود.
مراحل تهیه کاریوتایپ متافازی
- نمونهای از خون محیطی + هپارین (برای جلوگیری از لخته شدن)
- جداکردن گلبولهای سفید (با سانتریفوژ)
- کشت در محیط مناسب مانند RPMI
- اضافه کردن معرف سیتوژنیک مانند PHA (فتیوهماگلوتینین) به محیط به منظور تحریک تقسیم سلولهای T (شروع تقسیم پس از 48 ساعت است)
- انکوباسیون به مدت 72 ساعت
- اضافه کردن کلشیسین یا کلسمید به منظور جلوگیری از تشکیل رشتههای دوک و توقف سلول در مرحله متافاز
- قراردادن سلولها در محیط هیپوتونیک مثل KCl به منظور لیز شدن سلولهای قرمز و تورم سلول های سفید و چکاندن آنها روی لام
- فیکس کردن سلولها با حفظ مورفولوژی با استفاده از متانول و اسید استیک
- رنگآمیزی و مطالعه کروموزومها
محیط رشد
تمام نمونه‌ها برای آماده‌سازی کروموزومی در محیط مایع کشت داده و نگهداری میشوند. بعضی محیط‌ها برای سلولهای خاص فرموله میشوند ، در حالیکه سایر محیط‌ها برای طیف وسیعی از سلولها مناسب هستند (مانند PRMI 1640 و MEM). محیط‌های کشت از محلول‌های نمکی متعادل با مواد افزودنی شامل نمک‌ها، گلوکز و یک سیستم بافری برای حفظ pH مناسب تشکیل میشوند.
محیط‌های تجاری به فرم پودری در دسترس هستند که باید با آب مخلوط شوند و یا به صورت محلول‌های آماده وجود دارند. اکثر محیط‌های کامل و ناکامل به لحاظ تجاری در دسترس هستند اما بسیاری از محیط‌های تجاری ناکامل هستند. محیط‌های ناکامل تمام مواد غذایی و افزودنی‌های لازم برای رشد سلول را ندارند و قبل از کشت یک یا چند ترکیب باید به آن اضافه شود.
L – گلوتامین
L- گلوتامین یک اسیدآمینه ضروری برای رشد سلول است اما ناپایدار بوده و در طول نگهداری به D- گلوتامین تبدیل میشود که توسط سلولها قابل استفاده نیست. بنابراین برای پایدار ماندن فریز شده و بلافاصله قبل از استفاده به محیط کشت اضافه میشود. چندین محیط تجاری کامل وجود دارند که حاوی L- گلوتامین هستند.
سرم
سرم برای رشد سلولی خوب ضروری است. مقدار خیلی کم آن برای رشد حداکثری بعضی از سلولها کافی نیست و مقدر خیلی زیاد آن تأثیرات مخرب دارد. معمولا از سرم جنین گاوی (FBS) استفاده شده و آن به محیط کشت اضافه میگردد.
آنتی‌بیوتیک‌ها
برای جلوگیری از رشد میکروارگانیسم‌ها مهارکننده‌های میکروبی به محیط کشت افزوده میشوند. البته در بهترین حالت این کار یک راه حل موقتی است و هرگز نباید برای جبران بی‌دقتی در تکنیک‌های آسپتیک به آن اعتماد کرد. تکنیک‌های آسپتیک مناسب همیشه بهترین گزینه علیه آلودگی هستند.
آلودگی باکتریایی در کشت ایجاد کدورت می‌کند. آلودگی قارچی به صورت توده‌های پشمی با چشم غیرمسلح و یا به صورت هیف‌های منشعب زیر میکروسکوپ معکوس قابل مشاهده‌اند. تشخیص و رفع آلودگی‌های ویروسی و مایکوپلاسمایی دشوار است. اگر تغییرات و بازآرایی در کروموزومها بیش از حالت عادی مشاهده شود، باید آلودگی با مایکوپلاسما مدنظر قرار گیرد.
گروهبندی کروموزومها از نظر محل قرارگیری سانترومر
به 4 گروه تقسیم میشوند (کروموزومهای انسان جزء 3 گروه اول هستند)
- متاسانتریک (Metacentric): طول دو بازوی کروموزوم با هم برابر است مانند گروه F، 1 و 3 (گروه A) و 16 (گروه E).
- سابمتاسانتریک (Sub metacentric): سانترومر کمی از وسط کروموزوم انحراف دارد مانند بیشتر کروموزمهای انسان.
- آکروسانتریک (Acrocentric): یک بازوی خیلی کوتاه و یک بازوی بلند وجود دارد مانند گروه D، 22 و 21.
- تلوسانتریک (Telocentric): سانترومر در انتهای کرروموزوم قرار گرفته است.
هولوسانتریک: کروموزومهایی هستند که رشتههای دوک به نقاط مختلفی از آن ها میچسبد و در گیاهان و بعضی حشرات دیده میشود.
الگوی هتروکروماتینی
هتروکروماتین،نواحی از کروموزوم است که از نظر رونویسی غیرفعال بوده و ژنهای آن بیان نمیشود – دارای فشردگی زیاد و شدیداً رنگ پذیراست مانند
- نواحی DNA تکراری (که به ندرت نسخهبرداری میشود) در موجودات عالی
- قسمت اعظم کروموزوم Y
انواع هتروکروماتین
- سرشتی یا دائمی یا پایدار (Constitutive): همیشه از نظر رونویسی غیرفعال است مثل منطقه سانترومر و بازوی بلند کروموزوم های 1 ، 9 و 16
- اختیاری یا ناپایدار (Facultative): گاهی به یوکروماتین تبدیل میشود و باعث رونویسی از ژن مربوطه میگردد مثل کروموزوم X غیرفعال در جنس مونث.
نقش هتروکروماتین
- حفظ یوکروماتین از عوامل محیطی
- نقش در تکامل از نظر تأثیر بر میزان کراسینگاور
- تنظیم بیان ژن با خاموش کردن نواحی سانترومری
*نواحی هتروکروماتینی معمولاً در اواخر مرحله S همانندسازی میکنند (Late replicating).
*هر کروموزوم الگوی هتروکروماتینی مخصوص به خود را دارد.
الگوی نواربندی (Banding pattern)
نواربندی G (نواربندی گیمسا)
نواربندی G رایج‌ترین تکنیک نواربندی است. یکی از انواع آن نواربندی GTG (نوارهای G ایجاد شده با تریپسین و گیمسا) است که در این روش لام‌های تهیه و تیمار شده با آنزیم تریپسین و سپس رنگ گیمسا تیمار میشوند. این روش نوارهای تیره و روشنی ایجاد کرده که شناسایی هر کروموزوم را میسر می‌کند.
نواربندی Q (نواربندی کوئیناکربن)
نواربندی Q یک تکنیک فلورسنت است و نخستین روش نواربندی بود که برای کروموزومهای انسانی توسعه یافت. برخی فلوروکروم‌ها مانند کوئیناکربن دی هیدروکلراید به DNA متصل میشوند و وقتی با طول موج مناسبی تحریک شوند، الگوهای نواربندی تیره و روشن متمایز ایجاد میکنند. چون A-Tهای مجاور برای ایجاد جایگاه اتصال ضروری است در این تکنیک نواحی روشن غنی از A-T هستند. الگوی نواربندی Q به استثناء چند مورد مشابه نواربندی G است. مخصوصاً پلی مورفیک (چندشکلی) پری سانترومری در کروموزومهای 1 و 16 و ناحیه انتهایی بازوی بلند کروموزوم Y رنگ فلورسنت را گرفته و روشن دیده میشوند. ناحیه انتهایی بازوی بلند کروموزوم Y فلورسنت‌‌ترین ناحیه ژنوم انسان است. نواحی پلی مورفیک باند Q در سانترومر کروموزومهای 3 و 4 وجود دارند که با نواربندی G مشخص نمی‌شوند. بنابراین نواربندی Q برای تایید حضور کروموزوم Y و یا نواحی پلی مورفیک ذکر شده مناسب است.
نواربندی R (نواربندی معکوس)
مشابه روش G است ولی پیش از آن کروموزومها تحت گرما قرار میگیرند .در تکنیک‌های نواربندی R، الگوی نواربندی برعکس الگوهای نواربندی G و Q می‌باشد. این تکنیک به روش‌های فلورسنت و غیرفلورسنت تقسیم میشود.
نواحی یوکروماتینی و غنی از C-G، نوار تیره در G و نوار روشن در فلورسنت را ایجاد می‌کند. درحالیکه نواحی هتروکروماتینی غنی از A-T در G روشن و در فلورسنت تیره می‌باشند. باندهای مثبت R نواحی یوکروماتینی و فعال کروموزوم هستند. بسیاری از کروموزومهای انسانی پایانه‌های انتهایی یوکروماتینی دارند و از آنجایی که نواحی کم رنگ تلومر در زمینه محو میشوند، با تکنیک نواربندی G استاندارد به سختی مشاهده می‌گردند. نواربندی R یک تکنیک مناسب برای ارزیابی تلومرهاست و معمولاً به عنوان روش اضافه‌تر در بسیاری از کشورها استفاده میشود اما در فرانسه جز روش‌های استاندارد و متعارف نواربندی می‌باشد.
محرک‌های میتوز (میتوژن‌ها)
برخی سلولها مخصوصاً لنفوسیت‌های بالغ خود به خود تقسیم نمی‌شوند و باید با افزودن یک میتوژن مناسب، تقسیم آنها را در کشت سلولی تحریک کرد.
فیتوهماگلوتینین (PHA) عصاره لوبیا قرمز است که سبب تحریک تقسیم سلولی مخصوصاً در لنفوسیت‌های T میشود. تقسیم سلولی 48 ساعت بعد از افزودن PHA آغاز شده و در فواصل 24 ساعتی تکثیر صورت میگیرد. دوره‌های کشت برای نمونه‌های خونی براساس این اطلاعات صورت میگیرند. برای کشت متعارف خون محیطی معمولاً 72 ساعت مناسب است.