بیوراکتور

دستگاه فرمانتور | بیوراکتور چیست؟

فرمانتور دستگاهی است که شرایط بهینه را برای رشد میکرو ارگانیسم‌ها مثل قارچ و باکتری و مخمر فراهم می‌کند. میکرو ارگانیسم‌ها در این شرایط خاص، بهتر و بیش‌تر رشد وفعالیت خواهند کرد. استفاده از فرمانتور به میکرو ارگانیسم‌ها این امکان را می‌دهد که پیش از انتقال به مرحله‌ی تولید بیش از ده نسل رشد کنند. با اضافه کردن مخمرها تحت محیط بسته ای بر روی مواد کربوهیدراتی عمل فرمانتاسیون توام با حرارت و فشار صورت گرفته و تولید و ایجاد الکل می گردد .با این دستگاه می‌توان پارامترهای محیطی از جمله  pH، دما و فوم را مدام کنترل کرد. در صورت به هم خوردن تعادل محیط رشد میکرو ارگانیسم، دستگاه با هشدار دادن اپراتور را از تغییر نامناسب شرایط آگاه می‌کند.

فرمانتور ها به طور کلی به دو دسته تقسیم می شوند:

·فرمانتورهای آزمایشگاهی

.فرمانتورهای صنعتی

اجزای اصلی فرمانتور شامل موارد زیر است:

۱٫ وسل (Vessel)

۲٫ هیتر

۳٫ موتور

۴٫پانل (Panel)

۵٫ترنس میتر (Transmitter)

۶.صفحه‌ی نمایش (Monitor)

اجزای تشکیل دهنده فرمانتور آزمایشگاهی به نام Minifor :

-پایه صفحه تنظیم و اندازه گیری (panel)

-ظرف تخمیر همزن

-کنترل کننده دما- کنترل کننده و اندازه گیری pH

-تنظیم کننده و اندازه گیری ورودی هوا

خروجی هوا تلقیح و مجرای نمونه برداری

پمپ Peristalticو برنامه نرم افزاری کامپیوتر جهت کنترل فرایند تخمیر

کاربردهای فرمانتور

• تولید مواد اکتیو ، انواع داروها و واکسن‌ها برای دستیابی به درمان بسیاری از انواع بیماری‌ها (به خصوص هپاتیت، ایدز و سرطان)

• تولید انواع سرمهای مختلف

• تولید سموم ( مثال : زهر دیفتری به روش کشت معلق در فرمانتور)

استفاده از فرمانتور در پروژه های تحقیقاتی نظیر:

• تولید DNA پلاسمیدی جهت ایمن سازی با واکسن ژنی در فرمانتور به روش تخمیر پیوسته با کنترل میزان اکسیژن حل شده و pH

• مقایسه تولید بتاکاروتن توسط کپک (Blakeslea trispora) در فرمانتورهای پانزده لیتری همزن دار و هفتاد و پنج لیتری ایرلیفت

• دست یابی به روش تولید انبوه واکسن شاربن علامتی در فرمانتور

تجهيزات  فرمانتور | بیورآکتور چیست؟

فرمانتور يا بيوراکتور مجموعه ای متشکل از تجهيزات و قطعات مختلفی است که شرايط محيطی کنترل شده را برای رشد ميکربها و يا توليد متابوليت های خاص در محيط کشت مايع يا جامد را تحت شرايط استريل فراهم می کند. يک فرمنتور نيمه صنعتی مرسوم شامل اين تجهيزات می باشد:
1- اجزاء اساسی شامل موتور همزن، گرمکن، پمپ ها، سیستم کنترل گاز و غيره
2- ظروف و قطعات يدکی
3- تجهيزات جانبی شامل بطری معرف ها
4- ابزار دقيق و سنسورها

• مجموعه تجهيزات اشاره شده موارد زير را انجام می دهند:

1- اجرای عمليات تحت شرايط استريل
2- ثابت نگه داشتن دما (حفظ يک دمای خاص) با اندازه گيری و کنترل دما
3- فراهم نمودن اختلاط و هوادهی کافی
4- اندازه گيری و  کنترل pH  محيط داخل فرمنتور
5- سنجش و کنترل مداوم غلظت اکسيژن محلول
6- فراهم کردن امکان خوراک دهی محلول های خوراکی و معرف ها تحت شرايط استريل
7- فراهم کردن امکان دستيابی به نقاط زمانی مشخص برای تلقيح و نمونه گيری
8- استفاده از شکل هندسی مناسب برای افزايش مقياس
9- حداقل (کمينه کردن) نمودن اتلاف آب از ظرف
10- تسهيل شرايط رشد برای طيف وسيعی از ارگانيسم ها
بطور معمول در همه انواع فرمانتورها موارد فوق الذکر قابل انجام است.  البته با رشد روزافزون علم و تکنولوژی و امکان ساخت تجهيزات پيشرفت امکان اندازه گيری و سنجش مداوم متغيرها و پارامترهای مهم ديگری که مثل غلظت گلوکز، دانسيته سلولی (برای کشت های باکتريايي)، غلظت و ترکيب گازهای خروجی و ..... برای کاربردهای خاص فراهم شده است.
مواردی که در ادامه بحث می شود کوچکترين فرمنتور معمول در مقياس های نيمه صنعتی است که قابل استريل کردن در اتوکلاو است. البته برای مقياس های بالاتر نیز هم موارد اشاره شده وجود دارد ولی با اين تفاوت که، با افزایش مقیاس امکان استریل کردن آن با اتوکلاو وجود ندارد. در این حالت استریلیزاسیون فرمنتور بصورت درجا با جریان بخار تحت فشار در جداره یا داخل ظرف فرمنتور انجام می شود، که جهت آشنايي يک نمونه از اين فرمنتورها اشاره خواهد شد.
ظرف فرمانتور معمولا يک استوانه شيشه ای يک جداره يا دو جداره از جنس بورو سيليکات با ته مدور می باشد. صفحه بالايي از جنس استيل 316 L ساخته می شود که از طريق فلنچ ها و گيره های مناسب روی ظرف فرمنتور محکم می شود. يک اورينگ سيليکونی صفحه بالايي را از ظرف جدا می کند. دريچه های مناسب با اندازه های مختلف روی صفحه بالايي جهت قرار دادن سنسورهای مختلف، کندانسور، لوله های نمونه گيری، لوله های ورودی اسيد و باز (جهت کنترل pH)، ضد کف (جهت کنترل کف)، و خوراک و غيره تعبيه شده است. يک دريچه ويژه افزودن مايه تلقيح قرار داده شده که با قرار گرفتن يک غشاء سيليکونی امکان افزودن استريل مايه تلقيح را فراهم می کند.
محيط کشت از طريق لوله نمونه گيری که از طريق يکی از دريچه های صفحه بالايي در داخل محيط کشت قرار گرفته تحت شرايط استريل می تواند به ظرف نمونه گيری منتقل شود. توزيع کننده گاز از يک لوله استيل 316L  تشکيل شده است که از يک طرف در يکی از دريچه های صفحه بالايي محکم شده و از طرف ديگر با انتهای خميده (شبيه ثلث دايره) حاوی سوراخ های ريزی است که امکان پراکندن مناسب حباب های هوا را به داخل محيط کشت فراهم می کند.  تيغه های همزن معمولا از نوع راشتون می باشد روی شفتی که دقيقا در وسط صفحه بالايي قرار گرفته محکم شده و توسط نيرو موتور برقی قرار گرفته روی شفت با سرعت قابل تنظيم می چرخد.
از کندانسور برای حذف رطوبت همراه هوای خروجی از فرمنتور و بالطبع جلوگيری از اتلاف مايع در طی فرايند تخمير و همچنين مرطوب شدن و گرفتگی فيلتر هوای خروجی استفاده می شود. سنسور دما يک مقاومت پلاتينی باريک (Pt- 100) است که با تغيير مقدار مقاومت الکتريکی دمای محيط کشت داخل ظرف فرمنتور را نشان می دهد.
کنترل دمای فرمنتور با گرمايش مستقيم توسط يک بالشتک گرمکن (معمولا در مقياس آزمايشگاهی) برای ظرف فرمنتور یک جداره و يا گردش آب با دمای قابل تنظيم داخل ژاکت ظرف دو جداره انجام می شود. 
برای حالت اول جهت خنک کردن و يا کاهش دمای فرمنتور از کويل که می تواند از طريق يکی از دريچه های صفحه بالايي وارد محيط کشت شود با لوله های ورودی و خروجی آب استفاده می شود.
سنسورهای pH و اکسيژن که برای پایش مداوم و بدون وقفه  pH، اکسيژن محلول و شدت کف استفاده می شود از طريق دريچه های تعبيه شده در بالای فرمنتور (برای فرمنتورهای آزمايشگاهی)  و يا در ديواره (برای فرمنتورهای نيمه صنعتی و صنعتی جهت pH و اکسيژن محلول) و اتصالات مناسب در جاهای ويژه روی ظرف فرمنتور محکم می شوند. سنسور کف برای سنجش مداوم و بلادرنگ کف استفاده شده و از طريق اتصالات مناسب در جای ويژه خود روی صفحه بالايي محکم می شود. ارتفاع آن قابل تغيير بوده و بر اساس ارتفاع محيط کشت داخل ظرف فرمنتور تنظيم می شود.

انواع بیوراکتورها

راکتورهای همزن دار ( Stirred-Tank Reactor )

این نوع بیوراکتور به طور گسترده‌ای در صنعت استفاده می‌شود که با عبارت STR به صورت مخفف نشان می‌دهند. از دو کلمه Strrid-Tank bioreactor و Strrid-Tank Reactor می‌توانند به جای همدیگر استفاده کرد و مرز قابل تشخیصی بین آن‌ها وجود ندارد برای همین عبارت STR هم می‌تواند دلالت بر Strrid-Tank Bioreactor داشته باشد. از این بیوراکتورها برای مایع‌های ویسکوز، آبکی، کشت‌های با جریان هوای کم و حجم بزرگ بکار می‌رود. این نوع به ویژه برای تخمیرهایی که ریسه‌های قارچی فراوان در آن شرکت دارند و برای تولید بیوپلیمیرهایی که چسبناکی بالایی ایجاد می‌کنند، کاربرد دارد.

• بیوراکتورهای نوری (فوتو بیوراکتور)

یک فوتو بیوراکتور (PBR)، بیوراکتوری است که یک منبع نوری استفاده می‌کند (که می‌تواند نور طبیعی خورشید یا نور مصنوعی باشد). تقریباً هر ظرف شفافی می‌تواند یک بیوراکتور نوری خوانده شود، با این حال این اصطلاح بیشتر برای توصیف یک سیستم بسته استفاده می‌شود وکمتر در مورد مخازن یا حوضچه‌های باز مورد استفاده قرار می‌گیرند. بیوراکتورهای نوری برای رشد موجودات کوچک فوتوگرافیک (نوپرورد) مثل سیانوباکتری‌ها، جلبک‌ها یا گیاهان خزه مورد استفاده می‌شوند. این موجودات نور را به عنوان منبع انرژی خود استفاده کرده و نیازی به قندها یا چربی‌ها به عنوان منبع انرژی ندارند. در نتیجه، خطر آلودگی با موجودات دیگر مانند باکتری‌ها یا قارچ‌ها در بیوراکتورهای نوری در مقایسه با بیوراکتورهای دارای موجودات هتروتروف (همه چیزخوار) کمتر است.

• بیوراکتورهای شخصی

یک بیوراکتور پیوستهٔ ساده که برای اشخاص غیر حرفه ای طراحی شده‌است و آن‌ها را قادر می‌سازد تا باکتری‌های E-coli را تحت شرایط هوازی یا بی هوازی رشد دهند. این بیوراکتورها تواناییاتوکلاو شدن نداشته، و برای استفادهٔ مجدد وابسته به غیر فعالسازی شیمیایی هستند. این بیوراکتورهای شخصی برای رشد باکتری‌ها و محیط‌های کشت مناسب هستند.

• بیوراکتورهای تصفیهٔ فاضلاب

این بیوراکتورها برای تصفیهٔ فاضلاب و پساب‌ها طراحی شده‌اند. در کارآمدترین این سیستم‌ها، ذخیره ای از یک محیط کشت شیمیایی بی اثر با جریان آزاد وجود دارد که به عنوان بستری برای باکتری‌هایی که فاضلاب خام را تجزیه می‌کنند عمل می‌کند. دستگاه‌های هوادهی، اکسیژن را برای فاضلاب و محیط کشت تأمین می‌کنند که منجر به بیشتر شدن سرعت تجزیه می‌شود. مخلوط کن‌های قابل فرورفتن در آب در بیوراکتورهای اکسیژنی تلاطم را برای نگه داشتن مواد جامد در سوسپانسیون ایجاد می‌کنند و در نتیجه اطمینان حاصل می‌شود که باکتری‌ها و مواد آلی «با یکدیگر برخورد کنند».

از آن جا که میکروارگانیسم‌ها موتور تصفیهٔ فاضلاب‌های بیولوژیکی را پیش می‌برند، نظارت کمیت و کیفیت میکروارگانیسم‌ها در بیوراکتورها بسیار مهم است. یکی از این روش‌ها آزمون ATP نسل دوم است.

• بیوراکتور متلاطم بالا و پایین

همزدن‌های بالا و پایین که در این نوع بیوراکتور وجود دارد برای جلوگیری از استرس تیغه در سلول‌ها مفید می‌باشند. این کار بدون نیاز به روش سنتی پروانهٔ همزن دار که نیاز به یک موتور گران و کوپلینگ‌های (اتصالات) مغناطیسی دارند؛ انجام می‌شود. حرکت عمودی بالا و پایین در این بیوراکتورها بوسیلهٔ یک موتور به همراه یک غشای ارزان ایجاد می‌شود که استریل بودن را کاملاً حفظ کرده و مخلوطی کارآمد، بدون تشکیل گرداب را تولید می‌کند (هیچ تیغه ای مورد نیاز نیست). همچنین این نوع اختلاط با سلول‌ها ملایم تر بوده و کف کمتری تولید می‌کند. صفحه‌های تکان دهندهٔ جدیدی که با الهام حرکت دم ماهی‌ها ساخته شده‌اند و «دم ماهی» نام دارند، حداکثر بهره‌وری مخلوط کردن بدون لبه‌های برشی را در این بیوراکتورها ارائه می‌دهند.

• بیوراکتور شبیه‌سازی بافت ناسا (NASA)

طراحی بیوراکتورهایی که هدف آن‌ها رشد سلول‌ها یا بافت‌ها برای اهداف آزمایشگاهی یا درمانی می‌باشد، تفاوت بسیاری با بیوراکتورهای صنعتی دارد. بسیاری از سلول‌ها و بافت‌ها، به خصوص در پستانداران، باید یک سطح یا ساختار حمایتی دیگری برای رشد داشته باشند و اغلب، محیط‌های آشفته برای این نوع از سلول‌ها و بافت‌ها مخربند. موجودات عالی تر که آگزوتروفیک اند (auxotrophic)، نیز به محیط‌های رشد بسیار تخصصی نیاز دارند.

ناسا نوع جدیدی از بیوراکتور را که به طور مصنوعی بافت‌ها را در محیط کشت سلولی رشد می‌دهد، تولید کرده‌است. بیوراکتور بافت ناسا می‌تواند بافت قلبی، بافت عضلانی، رباط‌ها، بافت سرطانی و انواع دیگر بافت‌ها را برای مطالعه کشت دهد.

بيوراكتورهاي مهندسی بافت

به وسیله ای که در آن یک فرآیند زیستی یا بیوشیمیایی در شرایط کاملا کنترل شده (از نظر pH، دما، فشار، تامین مواد غذایی و حذف مواد زائد) توسعه می یابد و به دقت پایش می شود بیوراکتور می گویند. از ویژگی های مهم بیوراکتورها تکرارپذیری بالای آنها، کنترل و هدايت خودکار برای یک فرایند زیستی خاص است تا بتوان از کارکرد آنها برای افزایش مقیاس استفاده کرد. بیوراکتورها در فرایند های تخمیر صنعتی، تصفیه پساب، فرآوری مواد غذایی و تولید ترکیبات دارویی و پروتئین های نوترکیب (مثل آنتی بادی، فاکتور رشد، واکسن ها و آنتی بیوتیک ها) استفاده می شوند.

مهندسی بافت علمی است که از  کاربرد مفاهیم و روش های مهندسی و علوم زیستی برای توسعه محصولات زیستی برای ترمیم، پشتیبانی و بهبود عملکرد بافت استفاده می کند. در یکی از کاربرد های معمول، از اجتماع و پیوستگی سلولها بر روی یک داربست (scaffold) متخلخل، بافت با ساختار سه بعدی بوجود می آید که این داربست می تواند برای توسعه یک بافت استفاده شود و یا با سرعتی مشخص جذب و یا تجزیه شود. مهم ترین فاکتورهایی که در کشت بافت اثر گذار است تامین مواد غذایی و نیروهای مکانیکی وارد بر سلول های بافت است که تعیین کننده نوع بیوراکتور کشت بافت است.

مشکلات متداول در بيوراكتورهاي مهندسی بافت

1-    چند سلول برای ایجاد یک عملکرد خاص بواسطه بافت مورد نیاز است؟

2-    چگونه شرایط را مشابه داخل سلول ایجاد کنیم

• نیازمندی های تغذیه ای
• نیاز های ساختاری
• تکیه گاه مناسب مکانیکی و تنش برشی

3-    طراحی و نحوه کارکرد بیوراکتور

4-    افزایش مقیاس و بهره برداری

اهداف استفاده از بیوراکتور ها

• ایجاد الگو های اختلاط موثر و بذر پاشی یکنواخت فضایی برای داربست های سه بعدی  
• افزایش انتقال جرم اجزای شیمیایی محیط کشت به درون داربست
• تحریک فیزیکی (مثلا مکانیکی و هیدرودینامیکی) داربست- سلول طی مراحل رشد و توسعه

جنبه های طراحی راکتورها

• مقیاس ماکرو (شکل، اندازه، نوع اختلاط )
• مقیاس میکرو (آنالیز دقیقی از چگونگی انتقال مواد غذایی، حذف ضایعات و سموم (مثل اوره)، ایجاد محیط  برای ساپورت مواد )
• پارامتر های طراحی راکتور

Ø     هندسه راکتور (شکل و اندازه) که بستگی به نوع عملکرد مورد انتظار دارد،

Ø     جریان خوراک و حذف ضایعات

Ø     کنترل بیوراکتور (T, CO₂, O₂, pH)

Ø     کنترل و پایش عملکرد سلول

عوامل موثر در تفکیک سلولی

از آنجا كه شرايط اعمال شده براي كشت بافت ها بيشتر براي تكثير آنهاست بنابراين سلولها خصوصيات تفكيك يافتگي اوليه خود را از دست مي دهند. عوامل موثر بر تفكيك يافتگي:

• برهمکنش سلول –سلول
• برهمکنش های ماتریکس
• فاکتورهای محلول
• شکل سلول و جهت گیری سلول
• تنش های دینامیکی
• انتقال اکسیژن

محرك هاي مكانيكی

فشار هيدرواستاتيكي (فشار يا تنش)، جريان سيال (تنش برشي) محيطي شبيه به داخل سلول را ايجاد مي كند.

مورفولو‍‍‍‍ژي سلولي تحت تاثير قرار مي گيرد

براي توسعه يك بافت بايستي شرايطي مشابه با داخل سلول ايجاد كرد.

انواع بيوراكتور ها براي كاربرد در مهندسي بافت

•  بيوراكتور فلاسكي نخ تاب (Spinner-flask bioreactor) 

براي مقاصد بذر پاشي در داربست هاي 3 بعدي استفاده مي شوند. طي بذر پاشي، سلول ها به سطح و درون داربست ها بواسطه جابجايي منتقل مي شوند. طي كشت، چرخش باعث افزايش انتقال جرم خارجي مي شود ولي توليد توربلانسي و ادي نيز خواهي شد كه براي بافت مخرب است.

•  مخزن با ديواره چرخندهRotating-wall vessels

محيط ديناميكي با تنش پايين و انتقال جرم بالا فراهم مي كند. ديواره ظرف به صورتي مي چرخد كه نيروهاي درگ و سانتريفيوژي و نيروي وزني با هم به تعادل برسند. كه در نتيجه بافت در محيط كشت معلق مي ماند

•  بيوراكتور با رشته هاي توخاليHollow-fiber bioreactors

انتقال جرم را طي كشت بهبود  مي دهد و براي سلول هاي حساس و فعال (متابوليكي) مثل هپاتوسيت ها مفيد است. در شكل، سلول ها در ژل داخل فيبر قرار گرفته اند و محيط كشت از سطح خارجي رشته ها به داخل نفوذ مي كند.

• Direct perfusion bioreactors

محيط كشت از منافذ موجود در داربست عبور مي كند و اين نوع بيوراكتور براي بذر پاشي و يا ايجاد بافت هاي 3 بعدي كارايي دارد. در اين جا به واسطه عبور محيط كشت هم از پيرامون و هم از بين منافذ داربست، انتقال جرم بسيار افزايش مي يابد.

•  بيوراكتوري كه نيروي مكانيكي مشخص (مثل فشار ديناميكي) بر روي سازه هاي طراحي شده وارد مي كند و به عنوان سيستم مدل براي مواردي كه بافت تحت شرايط بار فيزيولوژيكي قرار مي گيرد و براي ساخت بافت هاي پيوندي با عملكرد ويژه به كار مي رود.

به عنوان مثال با بررسي كامپيوتري نيروهاي وارده و پاسخ سلولي مي توان از اين داده ها براي بررسي اثر نيروهاي مكانيكي بر روي توسعه بافت ها استفاده كرد و علاوه براين براي پيش بيني پاسخ بافت پيوند زده شده در مقابل نيروهاي فيزيولوژيكي استفاده كرد.