• Abstract

Magnetic nanoparticles are good candidates used for the targeted delivery of anti-tumor agents. They can be concentrated on a desired region, reducing collateral effects and improving the efficiency of the chemotherapy. We propose a method in which permanent magnets are implanted by laparoscopic technique directly in the affected organ. This method proposes the use of Fe@C nanoparticles, which are loaded with doxorubicin and injected intravenously. The particles, once attracted to the magnet, release the drug at the tumor region. This method seems to be more promising and effective than that based on the application of external magnetic fields.

r 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

  • خلاصه

نانوذرات مغناطیسی نامزدهای خوبی هستند که برای تحویل هدفمند عوامل ضد تومور استفاده می‌شوند. آنها را می توان در یک منطقه مورد نظر متمرکز کرد و اثرات جانبی را کاهش داد و کارایی شیمی درمانی را بهبود بخشید. ما روشی را پیشنهاد می کنیم که در آن آهنرباهای دائمی، با روش لاپاراسکوپی مستقیماً در اندام آسیب دیده کاشته می شوند. این روش استفاده از نانوذرات Fe@C را پیشنهاد می‌کند که با دوکسورابیسین بارگذاری شده و به صورت داخل وریدی تزریق می‌شوند. ذرات، پس از جذب آهنربا، دارو را در ناحیه تومور آزاد می کنند. به نظر می رسد این روش امیدوارکننده تر و مؤثرتر از روشی است که مبتنی بر کاربرد میدان های مغناطیسی خارجی است.

 

  1. Introduction

The targeted delivery of anti-tumor agents adsorbed on the surface of magnetic nanoparticles is a promising alternative to conventional chemotherapy. The particles, loaded with the drug, are concentrated at the target site with the aid of an external magnet. The drugs are then released on the desired area over a long period of time [1–6]. This local therapy could improve the efficiency of the treatment, reducing systemic toxicity.   However, we consider that the use of external magnets has serious limitations. The administration method is limited to an artery close to the tumor, it can only be applied to the treatment of superficial organs and, more over, well defined magnetic field geometries are needed to perform an efficient magnetic drug delivery [7–9]. To avoid these drawbacks, we propose the implant of small permanent magnets directly into the affected zone, creating an internal local magnetic field gradient, which would be rather more effective than those produced by external magnets. Our method allows a selective treatment of tumors localized in deep organs were a large field gradient of the order of 5 kOe/cm is achieved at the vicinity of the magnet. A recent theoretical approach modeled the behavior of magnetic fluids under the influence of a permanent magnet stent [10–13]. Preliminary in-vitro results of blood compatibility and drug uptake and release as well as a preclinical in-vivo experimental animal model are described, showing the reliability of the proposed method.

  1. معرفی

تحویل هدفمند عوامل ضد تومور جذب شده بر روی سطح نانوذرات مغناطیسی، یک جایگزین امیدوارکننده برای شیمی درمانی معمولی است. ذرات بارگیری شده با دارو، با کمک یک آهنربای خارجی در محل مورد نظر متمرکز می شوند. . سپس داروها در مدت زمان طولانی در ناحیه مورد نظر آزاد می شوند [6-1]. این درمان موضعی می تواند کارایی درمان را بهبود بخشد و سمیت سیستمیک را کاهش دهد. با این حال، ما در نظر داریم که استفاده از آهنرباهای خارجی دارای محدودیت های جدی است. روش تجویز محدود به شریان نزدیک به تومور است، آن را فقط می توان برای درمان اندام های سطحی اعمال کرد و علاوه بر آن، هندسه های میدان مغناطیسی به خوبی تعریف شده برای انجام یک داروی مغناطیسی کارآمد مورد نیاز است [9-7]. برای جلوگیری از این اشکالات، ما کاشت آهنرباهای دائمی کوچک را مستقیماً در ناحیه آسیب دیده پیشنهاد می کنیم، که یک گرادیان میدان مغناطیسی داخلی داخلی ایجاد می کند، که نسبت به آهنرباهای خارجی موثرتر است. روش ما امکان درمان انتخابی تومورهای موضعی در اندام‌های عمیق را فراهم می‌کند، در صورتی که یک گرادیان میدان بزرگ از مرتبه 5 kOe/cm در مجاورت آهن‌ربا به دست می‌آید. یک رویکرد نظری اخیر رفتار سیالات مغناطیسی را تحت تأثیر استنت آهنربای دائمی مدلسازی کرد [13-10]. نتایج اولیه در شرایط آزمایشگاهی سازگاری خون و جذب و آزادسازی دارو و همچنین یک مدل حیوانی آزمایشگاهی in-vivo بالینی شرح داده شده‌اند که قابلیت اطمینان روش پیشنهادی را نشان می‌دهد.

  1. Materials and methods
    • Preparation of the magnetic biofluids

The magnetic particles used for this research are Fe@C 200 nm core-shell nanoparticles, synthesized by means of the arc-discharge method [14]. The Kra¨tschmer-Huffmann  method [15] uses a cylindrical chamber with two graphite electrodes: a stationary anode containing iron powder (ALFA-AESAR) with a beginning size of 10 mm, and a moveable graphite cathode (ALDRICH). An arc is produced between the graphite electrodes in a helium atmosphere. The graphite electrode is sublimed and builds up a deposit on the inner surface of the chamber. The material collected from this deposit consisted of carbon nanostructures, amorphous carbon, and iron and iron oxide nanoparticles encapsulated in graphitic layers. Non coated or partially coated magnetic particles, which are not biocompatible, were eliminated by chemical etching. For magnetic purification, stable suspensions of the particles were prepared in a surfactant solution made from 2.5 g of SDS in 500 ml of distilled water. A field gradient produced by a 3 kOe permanent magnet was used for magnetic separation of this suspension. The purified material was washed with 3 M HCl at 80 1C to dissolve the exposed magnetic material and to form carboxylic groups on the carbon coating. This hydrophobic coating contributes to the stability of the magnetic suspensions. The resulting powder was then filtered. To prepare the biocompatible magnetic suspensions 100 mg of particles were suspended in 100 ml of Gelafun dines, a commercial succinylated gel commonly used as plasma substitute of blood, and sonicated for 15 min. Human blood from 5 healthy volunteer donors was tested in vitro, before and after being mixed with the particle suspension in different dilutions (1 ml of blood and 0.06; 0.12; 0.24 and 0.5 ml of particles). The same procedure was followed for the ex-vivo tests in 10 noninjected control New Zealand rabbits and 10 test animals after intravenous injection of 1 ml of the particle suspension in Gelafun dines. Blood samples were taken 10’, 30’ and 24 h after the injection of particles.

  1. مواد و روش ها
    • تهیه سیالات زیستی مغناطیسی

ذرات مغناطیسی مورد استفاده برای این تحقیق، نانوذرات هسته-پوسته 200 Fe@C نانومتری هستند که با استفاده از روش تخلیه قوس سنتز شده اند [14]. روش Kratschmer-Huffmann [15] از یک محفظه استوانه ای با دو الکترود گرافیتی استفاده می کند: یک آند ثابت حاوی پودر آهن (ALFA-AESAR)  با اندازه ابتدایی 10 میلی متر، و یک کاتد گرافیت متحرک (ALDRICH). یک قوس بین الکترودهای گرافیتی در اتمسفر هلیوم ایجاد می شود. الکترود گرافیتی تصعید شده و رسوبی در سطح داخلی محفظه ایجاد می کند. مواد جمع‌آوری‌شده از این کانسار شامل نانوساختارهای کربنی، کربن آمورف و نانوذرات آهن و اکسید آهن است که در لایه‌های گرافیتی محصور شده‌اند. ذرات مغناطیسی بدون پوشش یا تا حدی پوشش داده شده، که زیست سازگار نیستند، با اچ شیمیایی حذف شدند. برای خالص سازی مغناطیسی، سوسپانسیون های پایدار ذرات در محلول سورفکتانت ساخته شده از 2.5 گرم SDS در 500 میلی لیتر آب مقطر تهیه شد. برای جداسازی مغناطیسی این تعلیق از یک گرادیان میدان تولید شده توسط یک آهنربای دائمی 3 kOe استفاده شد. مواد خالص شده با 3 مولار هیدروکلراید در دمای 80 درجه سانتیگراد شسته شد تا مواد مغناطیسی در معرض انحلال قرار گیرد و گروه های کربوکسیلیک روی پوشش کربن تشکیل شود. این پوشش آبگریز به پایداری تعلیق های مغناطیسی کمک می کند. سپس پودر حاصل فیلتر شد. برای تهیه سوسپانسیون‌های مغناطیسی زیست سازگار، 100 میلی‌گرم ذرات در 100 میلی‌لیتر ژل گلافون، یک ژل سوکسینیل تجاری که معمولاً به عنوان جایگزین پلاسما خون استفاده می‌شود، تعلیق شد و به مدت 15 دقیقه تحت فراصوت قرار گرفت.  خون انسان از 5 اهداکننده داوطلب سالم در شرایط آزمایشگاهی، قبل و بعد از مخلوط شدن با سوسپانسیون ذرات در رقت های مختلف (1 میلی لیتر خون و 0.06؛ 0.12؛ 0.24 و 0.5 میلی لیتر ذرات) آزمایش شد. همین رویه برای آزمایش‌های ex-vivo در 10 خرگوش نیوزیلندی شاهد غیر تزریقی و 10 حیوان آزمایشی پس از تزریق داخل وریدی 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون ذرات در غذای Gelafun دنبال شد. نمونه خون، 24 , 30’,10’ ساعت پس از تزریق ذرات گرفته شد.

  • In-vitro experiments

To test the biocompatibility of the particles in contact with circulating blood, we performed a series of hemato logical and rheological tests. These hemorheological parameters are usually recommended for biocompatibility [16], conventional radiological contrast media [17] and paramagnetic nanoparticle magnetic resonance imaging [18] testing. We have followed these protocols and adapted them to nanoparticles in the blood stream. Nanoparticles are similar in shape and length to large circulating plasma proteins such as fibrinogen and immunoglobulins. As these proteins have a decisive influence on plasma and blood viscosity, we have some concern on the possible effect of the nanoparticles on these two parameters. Moreover, another important parameter includes the possible increase of blood erythrocyte aggregation, which could have a dramatic effect on the micro-vessel circulation. The blood viscosity was measured with a Brookfield® DV-3 cone-plate viscometer at different shear stresses (230,23 and 5.7 ). Plasma viscosity was also measured with a  capillary viscometer (Fresenius). We have determined the erythrocyte aggregation using a Mirenne aggregometer after 5 and 10 s of stasis and after 5 and 10 s of very low shear stress (3 ). The applied shear stress simulates the circulating blood in veins, capillaries and arteries. We have also done a complete blood cytometry, including differ ential leukocyte counting, using a hematology cell counter (Coulter LH-750®). Coagulation tests performed include the prothrombin time (PT), thromboplastin time, fibrino gen (ACL-9000® coagulation analyzer and Hemosil IL® kit), and D dimer immuno-turbidimetry (turbiquant D dimer Dade-Behrings). All coagulation tests before and after mixing of human blood with different concentrations of nanoparticles were within the normal range. No D-dimer levels over 200 mg/liter were detected. Higher levels would be expected in case of activation of the coagulation system. There are neither statistical, nor clinical significant differences between control blood and blood with different concentrations of  particles. The results of human blood rheology are summarized in Table 1. The ex-vivo tests with rabbit blood samples showed no significant differences between blood samples taken up at different times after the injection of particles. PT and activated partial thromboplastin time (APTT) were slightly longer in test rabbits than in controls but the difference was not statistically significant. From a clinical point of view, some test rabbits were in a very mild hypo-coagulation state that did not exceed the recommended value for prevention of thrombosis during

surgery. PT and APTT experimental/control ratios were 1.35 and 1.15, respectively. The recommended ratios in humans for prophylaxis of thrombosis range from 2.0 to 3.0. The dispersant may contribute in part to this mild hypo-coagulation state in test rabbits, which is still within the tolerable limits. Fibrinogen was moderately elevated in test rabbits, as expected, because fibrinogen is an acutephase reactant. Nevertheless the slight rise in fibrinogen is in the upper-normal range; it is within the tolerable limits and can be attributed to the stress produced for invasive procedures. Hemoglobin, erythrocytes, leukocytes (including differential count) and platelets were in the normal range both before and after the intravenous administration of particles. There were neither statistical, nor clinical significant differences. The above data measured in normal human laboratory tests showed good biological compatibility. Mild adverse effects, however, could be detected with more sophisticated coagulation tests that will be performed in a second step. These effects include aggregation of platelets, prothrombin fragment 1+2 and thrombin–antithrombin complex. Platelets aggregates were detected neither by the cell counter nor by microscopic examination. However, we have not explored a possible inhibition of platelet aggregation yet. This can be done with different inductors: thrombin, epinephrine or collagen. Prothrombin fragment 1+2 and thrombin–antithrombin complexes detect minimal activation of coagulation, but are not routine tests and usually reserved for research purposes in human pathology [19]. We have in mind to adapt these techniques to rabbit blood and explore them in a second step. The capability of the particles to spontaneously adsorb and release a drug has been studied using magnetic separation and UV spectroscopy. The kinetics of adsorption was measured following the procedure described by Kuznetsov: a 100 mg/ml solution of doxorubicin hydrochloride was mixed with 1 mg/ml of the particles in distilled water [20]. The suspension was incubated on a shaker at room temperature, and samples were taken after 5, 15, 30, 60, 90, 120 and 180 min. The adsorbent magnetic phase was magnetically separated in a gradient field produced with a 3 kOe permanent magnet, and the optical density of the supernatant measured with a UV spectrophotometer at 498 nm. The concentration of the adsorbed drug was then calculated. We observed that the adsorption was completed after 3 h of incubation. The adsorption and desorption areas of the particles, obtained by the BET method, were 35 and 14 m2 /g, respectively. The doxorubicin desorption kinetics was studied in trying to simulate in-vivo conditions. Five milligrams of the particles were incubated in a solution of doxorubicin, separated magnetically, and resuspended in 5 ml of human plasma. The suspension was incubated at 36 1C under mild stirring. The magnetic phase was magnetically separated, and the optical density of the supernatant measured with a UV spectrophotometer at 296 nm in 2 h intervals during the first day and every 8 h thereafter. The particles slowly released the drug, and after 3 d desorption was complete. Although it needs to be proven in in-vivo experiments, this result confirms that doxorubicin is released from the surface of our particles at a slow enough rate to reach the affected organs and efficiently treat a tumor.

  • آزمایشات آزمایشگاهی

برای آزمایش زیست سازگاری ذرات در تماس با خون در گردش، یک سری آزمایش‌های هماتو منطقی و رئولوژیکی انجام دادیم. این پارامترهای همورهولوژیک معمولاً برای آزمایش زیست سازگاری [16]، محیط های کنتراست رادیولوژیکی معمولی [17] و تصویربرداری تشدید مغناطیسی نانوذرات پارامغناطیسی [18] توصیه می شوند. ما این پروتکل ها را دنبال کرده و آنها را با نانوذرات موجود در جریان خون تطبیق داده ایم. نانوذرات از نظر شکل و طول شبیه به پروتئین‌های بزرگ پلاسما در گردش مانند فیبرینوژن و ایمونوگلوبولین‌ها هستند. از آنجایی که این پروتئین‌ها تأثیر تعیین‌کننده‌ای بر پلاسما و ویسکوزیته خون دارند، نگرانی‌هایی در مورد تأثیر احتمالی نانوذرات بر این دو پارامتر داریم. علاوه بر این، یکی دیگر از پارامترهای مهم شامل افزایش احتمالی تجمع گلبول های قرمز است که می تواند تأثیر چشمگیری بر گردش خون ریز داشته باشد. . ویسکوزیته خون با ویسکومتر Brookfield® DV-3 مخروطی صفحه ای در تنش های برشی مختلف (230،23 و 5.7 ) اندازه گیری شد. ویسکوزیته پلاسما نیز با ویسکومتر مویرگی(Fresenius)  اندازه گیری شد. ما تجمع گلبول های قرمز را با استفاده از آگرگومتر Mirenne پس از 5 و 10 ثانیه استاز و پس از 5 و 10 ثانیه تنش برشی بسیار کم) (3  تعیین کرده ایم. تنش برشی اعمال شده، گردش خون را در وریدها، مویرگ ها و شریان ها شبیه سازی می کند. ما همچنین یک سیتومتری کامل خون، از جمله شمارش متفاوت لکوسیت‌ها، با استفاده از شمارنده سلول‌های خونی(Coulter LH-750®)  انجام داده‌ایم. تست های انعقادی انجام شده شامل زمان پروترومبین (PT)، زمان ترومبوپلاستین، فیبرینوژن (آنالایزر انعقادیACL-9000®  و کیت Hemosil IL®)، و ایمونو کدورت سنجی D دایمر (D dimer Turbiquant Dade-Behrings)  می باشد. تمام آزمایش‌های انعقادی قبل و بعد از اختلاط خون انسان با غلظت‌های مختلف نانوذرات در محدوده طبیعی قرار داشتند. هیچ سطح D-dimer بیش از 200 میلی گرم در لیتر تشخیص داده نشد. هیچ سطح D-dimer بیش از 200 میلی گرم در لیتر تشخیص داده نشد. سطوح بالاتر در صورت فعال شدن سیستم انعقاد انتظار می رود. تفاوت آماری و بالینی معنی‌داری بین خون کنترل و خون با غلظت‌های مختلف ذرات وجود ندارد. آزمایش های ex-vivo با نمونه های خون خرگوش تفاوت معنی داری بین نمونه های خون گرفته شده در زمان های مختلف پس از تزریق ذرات نشان نداد. PT و زمان ترومبوپلاستین جزئی فعال (APTT)  در خرگوش‌های آزمایش کمی طولانی‌تر از گروه کنترل بود، اما این تفاوت از نظر آماری معنی‌دار نبود. از نقطه نظر بالینی، برخی از خرگوش های آزمایشی در حالت هیپو انعقادی بسیار خفیف بودند که از مقدار توصیه شده برای پیشگیری از ترومبوز در حین عمل جراحی تجاوز نمی کرد. نسبت PT و APTT تجربی/کنترل به ترتیب 1.35 و 1.15 بود. نسبت های توصیه شده در انسان برای پیشگیری از ترومبوز بین 2.0 تا 3.0 است. پراکنده کننده ممکن است تا حدی به این حالت کم انعقادی خفیف در خرگوش های آزمایشی کمک کند، که هنوز در محدوده های قابل تحمل است. همانطور که انتظار می رفت فیبرینوژن در خرگوش های آزمایشی به طور متوسط ​​افزایش یافت، زیرا فیبرینوژن یک واکنش دهنده فاز حاد است. با این وجود، افزایش جزئی فیبرینوژن در محدوده طبیعی بالاتر است. این در محدوده قابل تحمل است و می تواند به استرس ایجاد شده برای روش های تهاجمی نسبت داده شود. هموگلوبین، گلبول های قرمز، لکوسیت ها (شامل شمارش افتراقی) و پلاکت ها هم قبل و هم بعد از تزریق داخل وریدی ذرات در محدوده طبیعی بودند. نه تفاوت آماری و نه بالینی معنی داری وجود نداشت. داده های فوق اندازه گیری شده در آزمایشات آزمایشگاهی انسانی معمولی سازگاری بیولوژیکی خوبی را نشان داد. با این حال، عوارض جانبی خفیف را می‌توان با آزمایش‌های انعقادی پیچیده‌تر که در مرحله دوم انجام می‌شود، شناسایی کرد. این اثرات شامل تجمع پلاکت ها، قطعه پروترومبین 1+2 و کمپلکس ترومبین-آنتی ترومبین است. تجمع پلاکت ها نه توسط شمارنده سلولی و نه با بررسی میکروسکوپی تشخیص داده شد. با این حال، ما هنوز یک مهار احتمالی تجمع پلاکتی را بررسی نکرده‌ایم. این را می توان با القاگرهای مختلف انجام داد: ترومبین، اپی نفرین یا کلاژن. قطعه پروترومبین 1+2 و کمپلکس های ترومبین-آنتی ترومبین حداقل فعال سازی انعقاد را شناسایی می کنند، اما آزمایشات معمولی نیستند و معمولاً برای اهداف تحقیقاتی در آسیب شناسی انسانی در نظر گرفته می شوند [19]. ما در نظر داریم که این تکنیک ها را با خون خرگوش تطبیق دهیم و در مرحله دوم آنها را کشف کنیم. توانایی ذرات برای جذب و انتشار خود به خود دارو با استفاده از جداسازی مغناطیسی و طیف‌سنجی UV مورد مطالعه قرار گرفته است. سینتیک جذب طبق روش توصیف شده توسط کوزنتسوف اندازه گیری شد: محلول 100 میلی گرم در میلی لیتر دوکسوروبیسین هیدروکلراید با 1 میلی گرم در میلی لیتر از ذرات در آب مقطر مخلوط شد [20]. سوسپانسیون روی شیکر در دمای اتاق انکوبه شد و پس از 5، 15، 30، 60، 90، 120 و 180 دقیقه نمونه برداری شد. فاز مغناطیسی جاذب به صورت مغناطیسی در یک میدان گرادیان تولید شده با یک آهنربای دائمی kOe 3 جدا شد و چگالی نوری مایع رویی با یک اسپکتروفتومتر UV در 498 نانومتر اندازه‌گیری شد. سپس غلظت داروی جذب شده محاسبه شد. مشاهده کردیم که جذب پس از 3 ساعت انکوباسیون کامل شد. سطح جذب و دفع ذرات به‌دست‌آمده با روش BET به ترتیب 35 و 14 متر مربع بر گرم بود. سینتیک دفع دوکسوروبیسین در تلاش برای شبیه‌سازی شرایط in-vivo مورد مطالعه قرار گرفت. پنج میلی گرم از ذرات در محلول دوکسوروبیسین انکوبه شدند، به صورت مغناطیسی جدا شدند و در 5 میلی لیتر پلاسمای انسانی مجدداً معلق شدند. سوسپانسیون در دمای 1 درجه سانتیگراد 36 تحت هم زدن ملایم انکوبه شد. فاز مغناطیسی به صورت مغناطیسی جدا شد و چگالی نوری مایع رویی با اسپکتروفتومتر UV در 296 نانومتر در فواصل 2 ساعت در روز اول و هر 8 ساعت پس از آن اندازه‌گیری شد. ذرات به آرامی دارو را آزاد کردند و پس از 3 روز دفع کامل شد. اگرچه نیاز به اثبات در آزمایش‌های درون تنی دارد، اما این نتیجه تأیید می‌کند که دوکسوروبیسین با سرعت کافی از سطح ذرات ما آزاد می‌شود تا به اندام‌های آسیب‌دیده برسد و به طور مؤثر تومور را درمان کند.

  • In-vivo experiments

Stable suspensions of the carbon coated iron nanoparticles were tested in an in-vivo preclinical animal model. Magnetic implants were inserted into the main organs of 36 New Zealand rabbits and the capability of the magnet to attract the magnetic particles was tested. The experimental procedure was previously evaluated by the Ethics Committee for Animal Research of the University of Zaragoza, code PI 19/04. During surgery, the rabbits were under general anesthesia with endotracheal intubation. An intravenous needle was inserted in the marginal ear vein, fixed in it, and a perfusion of a physiologic saline solution

 was initiated. Next, the peritoneal cavity was insufflated with CO2 through a Veress needle and a minilaparoscopic optic was introduced using a 5 mm trocar. Then, through an 8 French plastic trocar, and under endoscopic control, the lower pole of the left kidney was punctured, inserting a 4 × 2 mm cylindrical gold coated permanent magnet of neodymium–iron–boron. The right kidney was also punctured but no magnet was inserted. The purpose is to reproduce the same tissue damage as in the other kidney, and to have a control organ to compare the concentration of the particles attracted to the targeted organ. After controlling the absence of bleeding, the trocars were removed and the cutaneous insertion orifices were sutured. Two milliliters of the particle suspension were injected intravenously in the marginal ear vein of the rabbit. Different groups of animals were sacrificed by terminal anesthesia after half an hour, 2, 7, 14, 21 and 28 d, and the main organs (lungs, liver, spleen, kidneys and spine) were extracted for histological study. All the results obtained in histological analysis performed in samples obtained from different organs, showed the lack of Perls’ stain reaction, as was also observed in haematological test. These results confirmed the good encapsulation of the magnetic particle core, as confirmed by the morphological characterization of the particles [15]. From histological studies, we observed a larger particle concentration in the implanted kidney in comparison to the nonimplanted one. Although it is difficult to quantify the results, a significant quantity of the particles concentrates on the kidney in which a magnet has been inserted. This is an indication of the capability of the magnet to attract particles specifically to the target organ. Unfortunately, a relatively large amount of the particles was also concentrated in liver and spleen, whereas a very small amount of particles was found in the lungs of some animals. Despite the inert surface of our material, the size of the particles was big enough to be recognized by the

 macrophages of these organs, which capture, retain and eventually excrete the particles after several days. This fact could be a drawback for the purpose of delivering chemicals to specific targets in the body but, on the other hand, it could also be helpful for other applications, such as treatment of liver or spleen tumors, or for the treatment of leishmaniasis [21]. The obtained results open a new research direction that is under development to confirm these assumptions. In order to avoid the distribution of particles to the reticuloendothelial system, the biofluid was directly injected into the aorta. This procedure significantly increased the amount of nanoparticles concentrated at the target organ. Two alternatives for capture of particles by the macrophages are currently under investigation. One alternative consists of pegylating the particles, another on the previous treatment with clodronate liposomes which suppresses the action of the macrophages [22].

  • آزمایشات درون تنی

سوسپانسیون های پایدار نانوذرات آهن پوشش داده شده با کربن در یک مدل حیوانی بالینی in-vivo مورد آزمایش قرار گرفتند. ایمپلنت های مغناطیسی در اندام های اصلی 36 خرگوش نیوزیلندی قرار گرفتند و قابلیت آهنربا برای جذب ذرات مغناطیسی مورد آزمایش قرار گرفت. رویه آزمایشی قبلاً توسط کمیته اخلاق تحقیقات حیوانی دانشگاه ساراگوزا، کد PI 19/04 ارزیابی شده بود. در طی عمل جراحی، خرگوش ها تحت بیهوشی عمومی با لوله گذاری داخل تراشه قرار گرفتند. یک سوزن داخل وریدی در ورید گوش حاشیه ای قرار داده شد، در آن ثابت شد و پرفیوژن محلول فیزیولوژیک سالین آغاز شد. سپس حفره صفاقی با CO2 از طریق سوزن Veress بادکرده و با استفاده از یک تروکار 5 میلی متری، یک اپتیک مینی لاپاروسکوپی معرفی شد. سپس، از طریق یک تروکار پلاستیکی فرانسوی 8، و تحت کنترل آندوسکوپی، قطب پایینی کلیه چپ سوراخ شد و یک آهنربای دائمی با پوشش طلای 4×2 میلی متری از نئودیمیم-آهن-بور وارد شد. کلیه سمت راست نیز سوراخ شد اما آهنربایی وارد نشد. هدف بازتولید آسیب بافتی مشابه در کلیه دیگر و داشتن یک اندام کنترل کننده برای مقایسه غلظت ذرات جذب شده به اندام مورد نظر است. پس از کنترل عدم خونریزی، تروکارها برداشته شده و منافذ پوستی بخیه زده شد. دو میلی لیتر از سوسپانسیون ذرات به صورت داخل وریدی در ورید گوش حاشیه ای خرگوش تزریق شد. گروه های مختلف حیوانات پس از نیم ساعت، 2، 7، 14، 21 و 28 روز با بیهوشی پایانی قربانی شدند و اندام های اصلی (ریه، کبد، طحال، کلیه و ستون فقرات) برای بررسی بافت شناسی استخراج شدند. تمامی نتایج به‌دست‌آمده در آنالیز بافت‌شناسی انجام‌شده در نمونه‌های به‌دست‌آمده از اندام‌های مختلف، عدم واکنش رنگ‌آمیزی پرلز را نشان داد، همانطور که در آزمایش هماتولوژی نیز مشاهده شد. این نتایج محصورسازی خوب هسته ذرات مغناطیسی را تایید کرد، همانطور که توسط خصوصیات مورفولوژیکی ذرات تایید شد [15]. از مطالعات بافت شناسی، ما غلظت ذرات بیشتری را در کلیه کاشته شده در مقایسه با کلیه غیر کاشته شده مشاهده کردیم. اگرچه تعیین کمیت نتایج دشوار است، اما مقدار قابل توجهی از ذرات روی کلیه که آهنربا در آن وارد شده است متمرکز می شود. این نشانه ای از توانایی آهنربا برای جذب ذرات به طور خاص به اندام هدف است. متأسفانه، مقدار نسبتاً زیادی از ذرات نیز در کبد و طحال متمرکز شده بود، در حالی که مقدار بسیار کمی از ذرات در ریه برخی از حیوانات یافت شد. با وجود سطح خنثی مواد ما، اندازه ذرات به اندازه‌ای بزرگ بود که توسط ماکروفاژهای این اندام‌ها تشخیص داده شود، که ذرات را می‌گیرند، نگه می‌دارند و در نهایت پس از چند روز دفع می‌کنند. این واقعیت می تواند یک اشکال برای رساندن مواد شیمیایی به اهداف خاص در بدن باشد، اما از سوی دیگر، می تواند برای کاربردهای دیگر مانند درمان تومورهای کبد یا طحال یا برای درمان لیشمانیوز مفید باشد[21]. نتایج به‌دست‌آمده، مسیر تحقیقاتی جدیدی را باز می‌کند که برای تأیید این مفروضات در حال توسعه است. به منظور جلوگیری از توزیع ذرات به سیستم رتیکولواندوتلیال، بیو سیال مستقیماً به آئورت تزریق شد. این روش به طور قابل توجهی میزان نانوذرات متمرکز در اندام هدف را افزایش داد. دو جایگزین برای گرفتن ذرات توسط ماکروفاژها در حال حاضر تحت بررسی است. یک جایگزین شامل پگیله کردن ذرات است، دیگری در درمان قبلی با لیپوزوم های کلودرونات که عملکرد ماکروفاژها را سرکوب می کند [22].

 

  1. Conclusions

In this work we propose a novel method of drug delivery based on implanting a permanent magnet in the affected organ. In-vitro experiments showed the blood biocompatibility of the obtained magnetic fluids. We confirmed the high efficiency of our Fe@C nanoparticles in the uptake and release of doxorubicin. In-vivo experiments prove the adequacy of the method to concentrate nanoparticles at the region where the magnet was implanted.

  1. نتیجه گیری

در این کار ما یک روش جدید برای تحویل دارو بر اساس کاشت آهنربای دائمی در اندام آسیب‌دیده پیشنهاد می‌کنیم. آزمایشات آزمایشگاهی زیست سازگاری خون مایعات مغناطیسی به دست آمده را نشان داد. ما کارایی بالای نانوذرات Fe@C خود را در جذب و آزادسازی دوکسوروبیسین تأیید کردیم. آزمایش‌های درون تنی کفایت روش را برای متمرکز کردن نانوذرات در ناحیه‌ای که آهنربا کاشته شده است، ثابت می‌کند.

 

 

 

  • References

[1] K.J. Widder, A.E. Senyel, G.D. Scarpelli, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 58 (1978) 141.

[2] A.S. Lu¨bbe, C. Bergemann, W. Huhnt, et al., Cancer Res. 56 (1996) 4694.

[3] C. Alexiou, W. Arnold, R.J. Klein, et al., Cancer Res. 60 (2000) 641.

[4] Q.A. Pankhurst, J. Connolly, S.K. Jones, et al., J. Phys. D 36 (2003) 167.

[5] A.K. Gupta, M. Gupta, Biomaterials 26 (2005) 3995.

[6] V. Kalambur, B. Han, B.E. Hammer, et al., Nanotechnology 16 (2005) 1221. [7] M. Shinkai, J. Biosci. Bioeng. 94 (2002) 606.

[8] A.S. Lu¨bbe, C. Alexiou, C. Bergemann, J. Surg. Res. 95 (2001) 200.

[9] C. Alexiou, R. Jurgons, R. Schmid, J. Magn. Magn. Mater. 293 (2005) 389.

[10] M.O. Avile´s, A.D. Ebner, H. Chen, et al., J. Magn. Magn. Mater. 293 (2005) 605.

[11] H. Chen, A.D. Ebner, M.D. Kaminski, J. Magn. Magn. Mater. 293 (2005) 616. [12] A.J. Rosengart, M.D. Kaminski, H. Chen, et al., J. Magn. Magn. Mater. 293 (2005) 633.

[13] B.B. Yellen, Z.G. Forbes, D.S. Halverson, J. Magn. Magn. Mater. 293 (2005) 647.

[14] R. Ferna´ndez-Pacheco, M.R. Ibarra, J.G. Valdivia et al., in: Technical Proceedings of the 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show, Nanotechnology 2005, vol. 1, NSTI Publications, Danville, USA, pp. 144.

[15] W. Kra¨tschmer, L.D. Lamb, K. Fostiropoulos, et al., Nature 347 (1990) 354. [16] K. Nageswari, R. Banerjee, R.V. Gupte, et al., J. Biomater. Appl. 13 (1998) 74.

[17] W.H. Reinhart, B. Pleisch, L.G. Harris, et al., Clin. Hemorheol. Microcirc. 32 (2005) 227.

[18] K. Lind, M. Kresse, N.P. Debus, et al., J. Drug Target 10 (2002) 221.

[19] T. Iturbe, R. Cornudella, R. De Miguel, et al., Lancet 353 (1999) 2158.

[20] A.A. Kuznetsov, V.I. Filippov, O.A. Kuznetsov, et al., J. Magn. Magn. Mater. 194 (1999) 22.

 

[21] F. Chellata, Y. Merhi, A. Moreau, Biomaterials 26 (2005) 7260.

[22] J. Crettaz, P. Berraondo, I. Mauleo´n, et al., Hepathology 44 (2006) 623.