بافت شناسی

بافت شناسی چیست؟

بدن انسان از میلیاردها سلول با شکل متفاوت تشکیل شده است که در ساختارهای منظمی به نام بافت کنار هم قرار می‌گیرند. هر یک از این ساختارها وظیفه مشخصی در بدن بر عهده دارد. برای مثال بافت ماهیچه‌ای از کنار هم قرار گرفتن سلول‌های تحریک‌پذیری تشکیل می‌شود که با انتقال نیرو به اسکلت استخوانی، در حرکت دادن اندام‌های فوقانی و تحتانی نقش دارند. بافت شناسی شاخه‌ای از زیست‌شناسی است که نحوه کنار هم قرار گرفتن سلول‌ها برای تشکیل بافت، شکل سلول‌های هر بافت، نحوه برقراری ارتباط بین بافت‌های مختلف و تغییرات ایجاد شده در بافت‌ها به دلیل بیماری را بررسی می‌کند. در این مطلب پس از تعریف بافت شناسی، روش‌های بررسی بافت را توضیح می‌دهیم.

بافت شناسی چیست ؟

بافت‌شناسی یا «هیستولوژی» (Histology) بخشی از علم زیست‌شناسی است که به بررسی سازمان‌یافتگی سلول‌ها در ساختارهایی به نام بافت، فعالیت آن‌ها و ارتباط بافت‌های مختلف در یک اندام می‌پردازد. میکروسکوپ و انواع رنگ‌آمیزی سلولی ابزارهای اصلی متخصصین این رشته برای بررسی ارتباط شکل (مورفولوژی) و عملکرد (فیزیولوژی) بافت‌ها است. برای شروع این مطالعه لایه نازکی از بافت جانورای یا گیاهی با روش‌های نمونه‌برداری جدا شده و با روش‌های شیمیایی یا فیزیکی روی لام تثبیت می‌شود.

انواع بافت جانوری

بافت مجموعه‌ای از سلول‌های مشابه است که به‌وسیله اتصالات بین سلولی با هم در ارتباط هستند. اطراف این سلول‌ها از ترکیبی غیرسلولی به نام ماتریکس تشکیل می‌شود که در تشکیل بافت، انتقال پیام‌های شیمیایی و اتصال سلول‌ها به هم نقش دارد. بافت پیوندی یا «همبند» (Connective Tissue)، ماهیچه‌ای یا «عضلانی» (Muscle Tissue)، «عصبی» (Nervous Tissue) و «پوششی» (Epithelial Tissue) چهار بافت اصلی بدن انسان هستند که ساختار و فعالیت زیستی اندام‌های مختلف به آن‌ها بستگی دارد. این بافت‌ها در بدن تمام جانوران پرسلولی وجود دارد.

بافت پوششی

بافت پوششی یا اپیتلیال بخش خارجی اندام‌ها و دیواره داخلی مجاری بدن را می‌سازد. هر بافت پوششی از یک لایه سلول (اپیتلیوم ساده) یا چندین لایه سلولی (اپیتلیوم مطبق) تشکیل شده است و بر اساس شکل سلول‌ها یه انواع سنگفرشی، مکعبی، استوانه‌ای و انتقالی تقسیم می‌شود.

• بافت پوششی سنگفرشی: این بافت از سلول‌های دایره‌ای و صافی تشکیل شده است که هسته کوچک آن‌ها در مرکز سیتوپلاسم قرار دارد. این بافت پوشش یا آستر بافت‌های دیگر را ایجاد می‌کند. اپیتلیوم سنگفرشی ساده در اندام‌هایی که انتشار مواد ضروری است، وجود دارد. دیواره آلوئول‌های ریه و اندوتلیال مویرگ از این بافت پوششی تشکیل می‌شود. اما اپیتلیوم سنگفرشی مطبق آستر اندام‌هایی را می‌سازد که ارتباط آن‌ها با محیط خارجی احتمال فرسایش و آسیب آن‌ها را افزایش می‌دهد. بافت پوششی حفره دهان، پوست و واژن از این نوع است.
• بافت پوشششی مکعبی: ایت بافت از سلول‌های مکعبی با هسته مرکزی تشکیل می‌شود. اپیتلیوم مکعب ساده ساختارهای ترشحی بدن را می‌سازد. برای مثال سلول‌های غدد اندوکرین، دیواره توبول‌های نفرون و مجاری کلیه از این نوع بافت تشکیل شده است.
• بافت پوششی استوانه‌ای: طول سلول‌های این بافت از عرض آن‌ها بیشتر و هسته آن‌ها در یکی از طرفین سلول قرار دارد. به همین دلیل غشای سیتوپلاسمی این سلول‌ها به سه بخش بالایی، لومنی یا آپیکال (در تماس با حفره بدن)، پایه یا دیستال (در تماس با بافت پیوندی زیری) و جانبی (در تماس با سلول پوششی کناری) تقسیم‌بندی می‌شود. در سطح آپیکال این سلول‌ها مژک‌هایی وجود دارد که به حرکات کمک می‌کند. اپیتلیوم دیواره لوله گوارش (اپتلیوم ساده) و مجاری تنفسی (مطبق کاذب) از این نوع است. در دیواره لوله گوارش این سلول‌ها به جذب غذای گوارش‌یافته و انتقال آن‌ها جریان خون و لنف کمک می‌کنند. به علاوه سلول‌های گابلت، انواعی از اپتلیوم استوانه‌ای تمایزیافته هستند که با ترشح مخاط سطح مجاری بدن را مروطب نگه می‌دارند.
• بافت پوششی انتقالی: بافت پوششی انتقالی یا یوروتلیال فقط در سیستم دفع ادرار به ویژه مثانه و میزنای وجود دارد. سلول‌های این بافت در چند لایه منظم روی هم قرار گرفته‌اند اما آرایش آن‌ها در حالت استراحت مثانه تغییر می‌کند. کاهش ضخیم این بافت در زمان پر شدن مثانه امکان افزایش حجم مثانه را فراهم می‌کند. به همین دلیل به این بافت پوششی انتقالی (ضخامت بیشتر در مثانه خالی و ضخامت کمتر در مثانه پر) گفته می‌شود.

بافت پیوندی

بافت پیوندی از سلول‌هایی تشکیل شده است که در ماتریکسی از مواد آلی (رشته‌های پروتئینی و پلی‌ساکاریدها) و معدنی (آب و الکترولیت‌ها) قرار دارند. فیبروبلاست‌ها سلول‌های متحرک این بافت هستند که ژن کدکننده تمام پروتئین‌های ماتریکس در هسته آن‌ها وجود دارد و توانایی میتوز در آن‌ها حفظ شده است. در بعضی از بافت‌های پیوندی علاوه بر فیبروبلاست‌ها، سلول‌های ایمنی (ماکروفاژ، لوکوسیت و لنفوسیت‌) وجود دارد. بافت پیوندی سست، بافت پیوندی رشته‌ای، غضروف، استخوان، چربی و خون انواع بافت‌های پیوندی بدن انسان هستند که نوع سلول‌ها و ترکیب ماتریکس خارج سلولی آن‌ها متفاوت است.

بافت پیوندی سست

بافت پیوندی سست یا حفره‌ای ترکیبی از تمام بافت‌های پیوندی بدن را دارد. فیبروبلاست و ماکروفاژ سلول‌های این بافت و رشته‌های کلاژن، رشته‌های الاستیک فیبرهای پروئینی این بافت را تشکیل می‌دهند فضای بین سلول‌ها و فیبرهای پروتئینی این بافتن به وسیله ترکیب آب، الکترولیت‌ها و پلی‌ساکارید پر می‌شود. این بافت غشای محکم اما کشسانی اطراف و بین اندام‌های بدن تشکیل می‌دهد.

بافت پیوندی رشته‌ای

علت نامگذاری این نوع بافت پیوندی تعداد زیاد رشته‌های پروتئینی نسبت به سلول‌ها و بخش مایع ماتریکس خارج سلولی است. رشته‌های این بافت با دو آرایش نامنظم یا منظم موازی کنار هم قرار می‌گیرند.

• بافت پیوندی رشته‌ای منظم: این بافت ساختارهایی را می‌سازد که وزن و اصطکاک زیادی را تحمل می‌کنند. تاندون (ساختار متصل‌کننده ماهیچه به استخوان) و رباط (ساختار متصل‌کننده استخوان به استخوان) اسکلت بدن انسان از این بافت تشکیل شده است.
• بافت پیوندی رشته‌ای نامنظم: این بافت پیوندی در ساختار با اندام‌هایی شرکت می‌کند که فشار فیزیکی در جهات مختلف به آن وارد می‌شود. بافت پیوندی پوست از این نوع است.

• غضروف

  این بافت پیوندی مجموعه‌ای از کندروسیت‌ها، رشته‌های پروتئینی و ماتریکس پلی‌ساکاریدی است. بافت غضروفی را بر اساس نسبت ماتریکس به سلول‌ها و رشته‌های پروتئینی به غضروف هیالین، رشته‌ای و الاستیک تقسیم‌بندی می‌کنند.

  • غضروف هیالین: غضروف هیالین یا شفاف سر استخوان‌های بلند اسکلت بدن و در محل مفصل قرار دارد. این بافت اصطکاک دو استخوان در حرکت را کاهش می‌دهد و از آسیب فیزیکی آن‌ها جلوگیری می‌کند.
  • غضروف رشته‌ای: تعداد زیاد رشته‌های کلاژن استحکام این بافت را افزایش می‌دهد. این غضروف با تشکیل دیسک ستون فقرات از اصطکاک مهره‌ها در حرکت و آسیب بافت عصبی جلوگیری می‌کند.
  • غضروف الاستیک: تعداد بیشتر رشته‌های الاستیک نسبت به فیبرهای کلاژنی در این بافت سبب افزایش انعطاف‌پذیری و خاصیت کشسانی آن می‌شود. این بافت در ساختارهایی که وزن زیادی تحمل نمی‌کنند ازجمله لاله گوش و بخش جلویی بینی قرار دارد.

  استخوان

  استخوان محکم‌ترین بافت پیوندی است که ماتریکس آن از یک بخش شبیه به سایر بافت‌های پیوندی و یک بخش متفاوت تشکیل شده است. بخش آلی ماتریکس این بافت مثل سایر بافت‌های پیوندی از رشته‌های پروتئینی کلاژن و الاستیک تشکیل می‌شود. اما بخش معدنی آن از غلظت زیاد یون‌های کلسیم تشکیل شده که منجر به سخت شدن ماتریکس این بافت می‌شود.

• کاهش آب ماتریکس شکستن استخوان و کاهش مواد معدنی آن منجر به نرمی استخوان را به همراه دارد. استئوبلاست، استئوکلاست و استئوسیت سلول‌های این بافت پیوندی هستند.

  • استئوبلاست: استئوبلاست‌ها سلول‌های استخوانی اجدادی هستند که در رشد و بازسازی استخوان نقش دارند.
  • استئوکلاست: استئوکلاست‌ها با تجزیه ماتریکس معدنی استخوان به بازسازی بافت و تامین کلسیم خون از این بافت پیوندی کمک می‌کنند. این سلول‌ها لایه‌های سطحی بافت استخوان قرار دارند.
  • استئوسیت: این سلول‌ها در حفره‌های لاکونای ماتریکس قرار دارند و وظیفه آن‌ها حفظ پایداری شیمیایی بافت استخوانی است.

بافت پیوندی استخوان را می‌توان بر اساس سازمان‌یافتگی سلول‌ها و ماتریکس به دو نوع اسفنجی و فشرده تقسیم کرد. بافت استخوان فشرده شفت، تنه یا «دیافیز» (Diaphysis) استخوان‌های بلند و سطح استخوان‌های پهن را تشکیل می‌دهد. اما استخوان اسفنجی در دو انتها، سر یا «اپی‌فیز» (Epiphysis) استخوان‌های بلند و مرکز استخوان‌های پهن قرار دارد.

• بافت استخوانی فشرده: این بافت از زیرواحدهای اوستئون تشکیل شده است و مجرای هاورس یا «کانال هاورسیان» (Haversian Canal) در مرکز اوستئون، حفره برای عبور اعصاب و رگ‌های خونی استخوان ایجاد می‌کند. «لاملا» (Lamellae)، «لاکولا» (Lacunae) و «کانیکول» (Canaliculi) ساختارهای ماتریکسی این بافت هستند.
  • لاملا ماتریکس خارج سلولی سختی است که از فیبرهای کلاژن و بلورهای هیدروکسی آپاتیت تشکیل شده و در تشکیل واحدهای اوستئون شرکت می‌کند.
  • لاکولا حفره‌هایی در ماتریکس خارج سلولی و محل قرارگیری استئوسیت‌های این بافت هستند.
  • کانالیکول‌ها حفره‌های کوچکی بین لاکولا و لاملا هستند که زائدهای دندریتی اوستئوسیت در آن قرار دارد.
• بافت استخوانی اسفنجی: این بافت استخوانی از صفحه‌ یا تیغه‌های کوچکی به نام «ترابکیولا» (Trabeculae) تشکیل شده است که ساختار آن‌ها در ایجاد استحکام این بافت نقش دارد.

چربی

بافت چربی یا «آدیپوز» (Adipose Tissue) با وجود اینکه فیبروبلاست یا فیبرهای پروتئینی زیادی ندارد، یکی از بافت‌های پیوندی بدن انسان است. این بافت از سلول‌های چربی یا «آدیپوسیت‌هایی» (Adipocytes) تشکیل شده است که هسته غیرمرکزی دارند و مولکول‌های تری‌گلسیرید را برای تامین انرژی ذخیره می‌کنند. این بافت پیوندی عایق و ضربه‌گیری است که در تنظیم دمای بدن و محافظت از اندام‌ها نقش دارد.

خون

خون بافت پیوندی مایع بدن است. گلبول‌های قرمز یا اریتروسیت، گلبول‌های سفید یا لوکوسیت‌ها و پلاکت‌ها سلول‌های تشکیل‌دهنده این بافت پیوندی هستند مه در ماتریکسی به نام پلاسما قرار دارند. گلبول‌های سفید بیشترین درصد سلول‌های این بافت پیوندی را به خود اختصاص می‌دهند که وظیفه انتقال گازهای بدن (اکسیژن و دی‌اکسید کربن) را بر عهده دارند. لوکوسیت‌ها سلول‌های سیستم ایمنی و پلاکت‌ها سلول‌های مکانیسم انعقادی خون هستند.

آب فراوان‌ترین ترکیب این بافت پیوندی است و پروتئین‌های رشته‌ای در این ماتریکس وجود ندارد. آلبومین، ایمونوگلوبین‌ها و فاکتورهای انعقادی پروتئین‌های پلاسما و پتاسیم، سدیم، کلسیم، کلر و بی‌کربنات الکترولیت‌های آن را تشکیل می‌دهند.

بافت ماهیچه ای

بافت ماهیچه‌ای یکی از یافت‌های تحریک‌پذیر بدن انسان است به سه نوع صاف، اسکلتی و قلبی تقسیم می‌شود. تعداد هسته، آرایش پروتئین‌های انقباضی که سبب مخطط دیده شدن بافت زیر میکروسکوپ می‌شود، انقباض ارادی یا غیرارادی و جایگاه آن در بدن با هم متفاوت است.

• ماهیچه صاف: بافت ماهیچه صاف از کنار هم قرار فیبرهای (سلول‌های) دوکی‌شکل تشکیل شده است که هسته مرکزی دارند و مخطط نیستند. این بافت غیرارادی و تحت کنترل سیستم عصبی خودمختار بدن منقبض می‌شود. ماهیچه صاف در اندام‌های احشایی ازجمله مجاری ادراری و تناسلی، لوله گوارش و رگ‌های خونی قرار دارد. انقباض منظم این بافت نقش مهمی در حرکات لوله گوارش بر عهده دارد.
• ماهیچه اسکلتی: این بافت از سلول‌های بلند و استوانه‌ای با چند هسته غیرمرکزی تشکیل شده است. آرایش پروتئین‌های انقباضی اکتین و میوزین در این بافت به شکلی است که زیر میکروسکوپ مخطط دیده می‌شود. این بافت بخشی از دستگاه حرکتی انسان را می‌سازد و نیروی انقباضی آن به‌وسیله تاندون (بافت پیوندی رشته‌ای) به استخوان منتقل می‌شود. اتصال انتقال‌دهنده‌های عصبی سیستم عصبی پیکری به گیرنده غشایی این سلول‌ها با حرکت ارادی اندام‌های بدن همراه است.

• ماهیچه قلبی: این بافت ماهیچه‌ای از سلول‌های منشعب با هسته مرکزی تشکیل شده است. سلول‌های این بافت مثل ماهیچه اسکلتی زیر میکروسکوپ مخطط دیده می‌شوند. سلول‌های ماهیچه قلبی به شکل غیرارادی اما بدون نیاز به تحریک سیستم عصبی منقبض می‌شود و سیستم عصبی خودمختار تنها سرعت انقباض این بافت را تنظیم می‌کند. اتصالات شکافدار در غشای این سلول‌ها با اننتقال سریع جریان الکتریکی به انقباض همزمان قلب کمک می‌کند.

بافت عصبی

بافت عصبی یکی دیگر از بافت‌های تحریک‌پذیر بدن انسان است که از سلول‌های بسیار تخصص‌یافته به نام نورون تشکیل می‌شود. ساختار کلی تمام نورون‌ها از سه بخش دندریت، جسم سلولی و آکسون تشکیل شده است. دندریت و آکسون زوائد سیتوپلاسمی این سلول‌ها هستند که تعداد آن‌ها در نورون بخش‌های مختلف سیستم عصبی محیطی و مرکزی تفاوت دارد. جسم سلولی بخشی از نورون‌ها است که هسته، اندامک‌ها و بخش اصلی سیتوپلاسم را در خود جای می‌دهد. تغییر پتانسیل الکتریکی غشای دندریت به شکل جریان یونی به جسم سلولی و از جسم سلولی به آکسون منتقل می‌شود. سپس آکسون این جریان را به نورون بعدی، سلول ماهیچه‌ای یا اپیتلیوم ترشحی (غدد) منتقل می‌‌کند.

یاخته‌های پشتیبان یا نوروگلیا سلول‌های دیگر غیرتحریکی عصبی هستند که وظیفه محافظت و تامین موادغذایی نورون‌ها را بر عهده دارند. سلول‌های شوآن (در سیستم عصبی محیطی) و اولیگودندروسیت‌ها (در دستگاه عصبی مرکزی) نوروگلیایی هستند که غلاف میلین اطراف نورون را تشکیل می‌دهند.

نمونه برداری در بافت شناسی

اولین مرحله در مطالعه ساختارهای بافت سالم یا آسیب‌دیده جدا کردن نمونه از بیمار یا حیوان آزمایشگاهی با استفاده از روش‌های «اتوپسی» (Autopsy) و «بیوپسی» (Biopsy) است.

• بیوپسی: در این روش بخشی از بافت‌های سطحی، مایعات بدن یا بافت‌های داخلی فرد زنده برای بررسی آزمایشگاهی جدا می‌شود. در مراکز درمانی این روش معمولا پس از عکس‌برداری‌های پزشکی (ازجمله CT اسکن و MRI) و برای بررسی خوش‌خیمی توده‌ها یا میزان تغییر بافت به کار گرفته می‌شود. در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی از این روش برای تعیین میزان اثر دارو بر بافت، تغییر واکنش‌های آنزیمی، جهش‌های ژنتیکی و انواع تغییر بافت استفاده می‌شود.
• اتوپسی: در این روش بخشی از بافت داخلی یا سطحی از جسد برای تعیین علت مرگ جدا می‌شود. این فرایند در حیوانات آزمایشگاهی نکروپسی نام دارد.

انواع بیوپسی در بافت شناسی

برای تهیه نمونه از این روش بر اساس نوع و محل بافت می‌توان از بیوپسی سوزنی یا زیرجلدی، اندوسکوپی، پوستی و جراحی استفاده کرد.

• بیوپسی سوزنی: از این روش برای نمونه‌برداری از بافت پوست، بافت‌های سطحی (ماهیچه و استخوان) یا اندام‌های داخلی (ریه و کبد) استفاده می‌شود. این روش نمونه‌برداری به تشخیص دلیل عفونت، توده‌های سلولی و التهاب کمک می‌کند. آسپیراسیون سوزن باریک، بیوپسی سوزن مرکزی، بیوپسی همراه با خلا و بیوپسی همراه تصویربرداری انواع این روش نمونه‌برداری هستند.
  • آسپیراسیون سوزن باریک: در این روش از یک سوزن بلند و باریک برای جدا کردن نمونه سلولی یا مایع استفاده می‌شود.
  • بیوپسی سوزن مرکزی: در این روش از یک سوزن با قطر بیشتر برای جدا کردن نمونه بافت از بدن فرد زنده استفاده می‌شود.
  • بیوپسی همراه خلا: در این روش نمونه‌برداری سوزنی در این روش سیستم مکش به جدا کردن سلول یا مایع از بافت مشکوک کمک می‌کند. استفاده از این سیستم تعداد دفعاتی که سوزن برای برداشت نمونه وارد بافت می‌شود را کاهش می‌دهد.
• بیوپسی همراه تصویربرداری: در این روش از یک سیستم تصویربرداری (CT اسکن، MRI یا سونوگرافی) برای تعیین محل دقیق بافت مشکوک در اندام‌های عمقی مثل کبد، پروستات و ریه استفاده می‌شود.
• بیوپسی اندوسکوپی: در این روش بافت مشکوک به‌وسیله لوله نازکی (اسکوپ) که سر آن دوربین، چراغ و قیچی وجود دارد از بدن خارج می‌شود. بر اساس محل قرارگیری بافت مشکوک این لوله از مجاری ادراری، دهان، رکتوم یا برش کوچک ایجاد شده روی پوست وارد بدن می‌شود و ممکن است با بیهوشی یا بی‌حسی موضعی انجام شود. نمونه‌برداری مثانه سیستوسکوپی، نمونه‌برداری کولون کولونوسکوپی و نمونه‌برداری ریه برونشیوسکوپی نام دارد.

• بیوپسی پوستی: بیوپسی پوستی برای تشخیص بیماری‌های این بافت انجام می‌شود و بر اساس عمق سلول‌های مشکوک متفاوت است. در این روش سلول‌ها را با استفاده تیغ تیز (سلول‌های سطحی اپیدرم)، پانج (سلول‌های اپیدرم، درم و ناحیه بالایی بافت چربی)، برش کوچک (سلول‌های اپیدرم، درم و بخش‌های عمقی لایه چربی) یا برش عمقی (برداشت کامل بافت مشکوک) جدا می‌شوند.

• بیوپسی جراحی: در این روش پس از بی‌حسی موضعی یا بیهوشی عمومی جراح با ایجاد برش روی پوست بخشی از بافت مشکوک در اندام‌های داخلی را خارج می‌کند.

آماده سازی نمونه در بافت شناسی

پس از بیوپسی نمونه بافتی باید برای مشاهده زیر میکروسکوپ آماده شود. قالب‌گیری پارافینی وانجماد بافت دو روش متداول برای آماده‌سازی نمونه در آزمایشگاه‌های بافت‌شناسی و آسیب‌شناسی است. تثبیت (Fixation)، قالب‌گیری (Embedding)، برش (Sectioning) و رنگ‌آمیزی (Staining) چهار مرحله آماده‌سازی بافت برای مشاهده زیر میکروسکوپ هستند.

تثبیت بافت

این مرحله برای جلوگیری از تغییر ساختارهای مولکولی و سازمان‌یافتگی سلول‌ها در اثر استرس‌های فیزیکی و شیمیایی مراحل آماده‌سازی، آنزیم‌های اتولیز سلول و باکتری‌ها و به دو روش فیزیکی (انجماد) و شیمیایی (متداول‌تر) انجام می‌شود. از انجماد برای نمونه‌هایی استفاده می‌شود که زمان کمتری برای بررسی آن‌ها وجود دارد. برای مثال حین جراحی‌های تومور ممکن است پزشک برای ادامه عمل به آنالیز سریع بیوپسی تومور نیاز داشته باشد. نمونه تهیه شده با این روش پایداری کمتری دارد. اما در ساختار آنتی‌ژن‌ها و لیپیدهای سلول‌تغییر کمتری ایجاد می‌کند. زمان آماده‌سازی نمونه با روش انجمادی حدود ۱۰ دقیقه و قالب‌گیری پارافین حدود ۱۶ ساعت است.

کرایومیکروتوم ابزار اصلی برای تهیه نمونه به روش انجمادی است. در این روش نمونه روی دیسک فلزی قرار می‌گیرد، با بستر ژلی از جنس پلی‌اتیلن گلایکول یا پلی‌ونیل الکل قرار می‌گیرد و با سرعت در دمای ۲۰- تا ۳۰- منجمد می‌شود. بافت‌هایی که چربی یا لیپید بیشتری دارند در دمای پایین‌تری منجمد می‌شوند. نمونه منجمد شده به‌وسیله تیغه کرایومیکروتوم برش داده شده و پس از قرار گرفتن روی اسلاید رنگ می‌شود.

تثبیت‌کننده‌های شیمیایی از ترکیباتی تشکیل شده‌اند که با مولکول‌های زیستی اتصالات عرضی برگشت‌ناپذیر ایجاد می‌کنند. تثبیت شیمیایی بافت برای مطالعات بافت شناسی با میکروسکوپ نوری و الکترونی با استفاده از محلول‌های مختلف انجام می‌شود.

• فرمالین ۱۰٪ و فرمالدهید (۴٪) در بافر فسفات سالین متداول‌ترین تثبیت‌کننده‌های شیمیایی هستند که در مطالعات بافت شناسی با میکروسکوپ نوری از آن‌ها استفاده می‌شود.
• گلوتارآلدهید ۲٫۵٪ در بافر فسفات سالین، تتراکسید اسمیوم یا اوراسیل استات سه محلولی هستند که برای مشاهده بافت زیر میکروسکوپ الکترونی از آن‌ها استفاده می‌شود.

محلول‌های فرمالدهیدی با گروه‌های آمینی باقی‌مانده‌های آمینواسیدی پروتئین اتصال عرضی ایجاد می‌کنند. این فرایند فعالیت پروتئین‌ها به ویژه آنزیم‌ها را از بین می‌برد و اسید نوکلئیک‌های سلول (DNA و RNA) را دناتوره می‌کند.

قالب‌گیری

برای بررسی دقیق ساختارهای بافتی نیاز است لایه نازکی از آن (در حد امکان یک لایه سلولی) در اختیار داشته باشیم. برای این کار بافت را ابتدا در قالبی از پارافین (مطالعات بافت شناسی با میکروسکوپ نوری) یا رزین (مطالعات بافت شناسی با میکروب نوری و الکترونی) قرار می‌دهیم. فرایند قالب‌گیری در سه مرحله آبگیری، شفاف‌سازی و تشکیل غالب پارافینی انجام می‌شود.

• آبگیری: در این مرحله آب سیتوپلاسم و مایه میان‌بافتی از سلول خارج می‌شود تا فضا برای نفوذ ترکیب هیدروفوب پارافین فراهم شود. در این فرایند بافت به ترتیب در غلظت‌های مختلف اتانول (معمولا از ۷۰٪ تا ۱۰۰٪) قرار داده می‌شود.
• شفاف‌سازی: در این مرحله اتانول بافت به‌وسیله یک حلال آلی مثل زایلن جایگزین می‌شود. در مرحله بعد پارافین به راحتی در این حلال حل خواهد شد.
• تشکیل غالب پارافینی: در این مرحله بافت شفاف داخل پارافین مذاب (در دمای ۵۲ تا ۶۰ درجه سانتی‌گراد) غوطه‌ور شده و در آون قرار می‌گیرد. دمای پارافین محلول شفاف‌کننده را تبخیر و پارافین تمام فضای بافتی را پر می‌کند.

برش بافت

«میکروتوم» (Microtome) ابزاری است که برای تهیه برش‌های نازک بافت در مطالعات میکروسکوپ نوری و الکترونی از آن استفاده می‌شود. تیغه این دستگاه از جنس استیل، شیشه یا الماس ساخته می‌شود که به کمک آن می‌توان برش‌هایی با ضخامت ۵۰ میکرومتر تا ۶۰ نانومتر تهیه کرد. تیغه‌های استیل برای تهیه برش بافت جانوری و گیاهی در مطالعات میکروسکوپ نوری، تیغه‌های شیشه‌ای برای برش‌های میکروسکوپ نوری و الکترونی وتیغه‌های الماس برای تهیه برش از بافت‌های گیاهی و بافت‌های سخت جانوری ازجمله استخوان و دندان استفاده می‌شود. «اِسلد» (Sledge) یا سورتمه‌ای، «چرخشی» (Rotary)، سرمایشی یا «کرایو» (Cryomicrotome)، «لرزشی» (Vibrating) «اره‌ای» (Saw)، «اولترامیکورتوم» (Ultramicrotome) و «لیزری» (Laser) انواع این دستگاه هستند که نوع تیغه در آن‌ها متفاوت است.

• میکروتوم اسلد: در این دستگاه تیغه متحرک و جایگاه نگه دارنده نمونه (شاتل) ثابت است. به کمک این دستگاه می‌توان از نمونه‌های قالب‌گیری شده در پارافین، برش‌هایی با ضخامت ۱ تا ۶۰ میکرومتر برای مشاهده زیر میکروسکوپ نوری آماده کرد.
• میکروتوم چرخشی: در این دستگاه تیغه ثابت و جایگاه قرارگیری نمونه متحرک است. تفاوت میکروتوم چرخشی با دستی در نوع حرکت شاتل است. شاتل میکروتوم دستی در جهت افقی با زاویه ۱۸۰ درجه و شاتل میکروتوم چرخشی با زاویه ۳۶۰ درجه حرکت می‌کند. با استفاده از این دستگاه می‌توان برش‌هایی با ضخامت ۱ تا ۶۰ میکرومتر برای مشاهده زیر میکروسکوپ نوری آماده کرد.
• میکروتوم سرمایشی: از کرایومیکروتوم برای برش نمونه‌های بافتی منجمد شده استفاده می‌شود.
• اولترامیکورتوم: از این میکروتوم برای تهیه برش‌های بسیار نازک استفاده می‌شود. تیغه شیشه یا الماس این دستگاه ثابت است و نمونه با اضافه ۳۶۰ درجه می‌چرخد. برش‌های ۴۰ تا ۱۰۰ نانومتری این دستگاه را می‌توان به راحتی با میکروسکوپ الکترونی مطالعه کرد.
• میکروتوم لرزشی: لرزش تیغه در این میکروتوم‌ها فشار لازم برای برش نمونه را کاهش می‌دهد. با استفاده از این دستگاه می‌توان برش‌های ۳۰ تا ۵۰۰ میکرومتری از بافت زنده و ۱۰ تا ۵۰ میکرومتری از بافت تثبیت شده برای مشاهده زیر میکروسکوپ نوری تهیه کرد.
• میکروتوم اره‌ای: از این میرکوتوم برای برش بافت‌های سخت ازجمله دندان و استخوان استفاده می‌شود. به‌وسیله تیغه اره‌ای و متحرک این میکروتوم می‌توان برش‌های با کمترین ضخامت ۳۰ میکرومتر تهیه کرد.
• میکروتوم لیزری: برای تهیه برش به‌وسیله تیغه لیزری (اشعه IR) این دستگاه نیاز به آماده‌سازی با روش سنتی (انجماد، تثبیت و قالب‌گیری) نیست. از این روش می‌توان برای تهیه نمونه‌های بافت سخت با ضخامت ۱۰ تا ۱۰۰ میکرومتر استفاده کرد.

رنگ‌آمیزی

نمونه‌های قالب‌گیری شده با پارافین یا رزین و نمونه‌های انجماد را باید برای مشاهده با میکروب رنگ‌آمیزی کرد. بر اساس نوع ساختاری که بررسی آن در بافت مهم است می‌توان از روش‌های رنگ‌آمیزی مختلف استفاده کرد. رنگ‌آمیزی هماتوکسین-ائوزین متداول‌ترین روش رنگ‌آمیزی در آزمایشگاه‌های بافت‌شناسی و آسیب‌شناسی است. رنگ بازی هماتوکسین با ساختارهای اسیدی سلول (RNA، DNA، ریبوزوم و شبکه اندوپلاسمی) و رنگ اسیدی ائوزین اسیدی با ساختارهای بازی (ماتریکس خارج سلولی) آن برهم‌کنش می‌دهد. سافرانین، روغن قرمز O، قرمز کونگو و نمک نقره ازجمله رنگ‌هایی هستند کمه علاوه بر هماتوکسین-ائوزین در بافت شناسی کاربرد دارند.

• سافرانین: این رنگ آزونیوم در آزمایشگاه‌های بافت‌شناسی برای رنگ‌آمیزی بافت‌های غضروفی، مخاط و گرانول‌های سیتوپلاسمی ماست‌سل‌ها استفاده می‌شود.
• روغن قرمز O: از این رنگ محلول در چربی برای رنگ‌آمیزی تری‌گلیسریدها و لیپوپروتئین‌های بافت قالب‌گیری شده در پارافین استفاده می‌شود. با استفاده از این رنگ می‌توان وزیکول‌های سیتوپلاسمی لنفوسیت‌ها در لوکمیا، پلاک چربی دیواره رگ در آترواسکروزیس و تجمع چربی در بافت کبد را تشخیص داد.
• قرمز کونگو: از این روش برای رنگ‌آمیزی فیبرهای آمیلوئیدی (توده‌های پروتئینی) در آزمایشگاه‌های بافت شناسی استفاده می‌شود.
• نمک نقره: این رنگ‌آمیزی برای بررسی بافت‌های عصبی در آزمایشگاه بافت شناسی کاربرد دارد. استفاده از نمک نقره یکی از روش‌های متداول رنگ‌آمیزی برای تشخیص بتا آمیلوئیدها در بیماری آلزایمر است. توده‌های آمیلوئیدی پس از رنگ‌آمیزی بر اساس اندازه زیر میکروسکوپ زرد تا مشکی دیده می‌شوند.

انواع میکروسکوپ بافت شناسی

پس از آماده‌سازی نمونه می‌توان ساختارهای بافتی را به‌وسیله میکروسکوپ نوری یا الکترونی مشاهده کرد. در میکروسکوپ‌های نوری از پرتوهای فوتونی و میکروسکوپ الکترونی از پرتوهای الکترونی برای تشکیل تصویر استفاده می‌شود. به همین دلیل بزرگنمایی میکروسکوپ‌های الکترونی از نوری بیشتر است و به کمک آن‌ها می‌توان نانوساختارهای داخلی سلول را مشاهده کرد.

میکروسکوپ نوری

میکروسکوپ نوری یا چشمی یکی از ابزارهای آزمایشگاه زیست‌شناسی و بافت شناسی است که از نور مرئی و عدسی‌های محدب برای بزرگنمایی اجسام بسیار ریز بهره می‌برد. بزرگنمایی میکروسکوپ‌های نوری به تعداد و نوع عدسی بستگی دارد. میکروسکوپ‌های نوری بر اساس تعداد عدسی به دو نوع ساده و ترکیبی تقسیم می‌شوند.

• میکروسکوپ نوری ساده: سیستم نوری این دستگاه از یک عدسی (نزدیک نمونه) تشکیل شده است. به همین دلیل بزرگنمایی کمی دارد. رزولوشن یا قدرت تفکیک این دستگاه ۲۰۰ نانومتر است.
• میکروسکوپ نوری ترکیبی: سیستم نوری این دستگاه حداقل از دو عدسی تشکیل می‌شود و بزرگنمایی بیشتری از میکروسکوپ‌های ساده دارد. عدسی شئی نزدیک نمونه و عدسی چشمی در اختیار کاربر است. رزولوشن یا قدرت تفکیک این دستگاه ۰٫۱ نانومتر است.

در این دستگاه نور پس از عبور از عدسی «کاندنسور» (Condenser) یا متمرکزکننده روی نمونه کوچک و شفاف متمرکز می‌شود. نور خروجی از نمونه با عبور از یک یا دو عدسی بزرگ‌نمایی شده و کاربر تصویر بزرگ‌نمایی شده را مشاهده می‌کند. به طور کلی هر میکروسکوپ نوری از چند بخش مشترک تشکیل شده است که در شکل زیر مشاهده می‌کنید.

میکروسکوپ نوری زمینه روشن، میکروسکوپ نوری فاز کنتراست، میکروسکوپ نوری زمینه تیره و میکروسکوپ‌های فلورسنت انواع میکروسکوپ نوری هستند که از روش‌های رنگ‌آمیزی مختلف برای مشاهده نمونه به‌وسیله آن‌ها استفاده می‌شود.

• میکروسکوپ نوری زمینه روشن: این میکروسکوپ در بیشتر آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی و بافت‌شناسی برای مشاهده نمونه‌ها استفاده می‌شود. نمونه تیره در این میکروسکوپ‌ها روی زمینه روشن نمایش داده می‌شود. در این دستگاه چند عدسی شیئی با بزرگ‌نمایی 10X، 40X و 100X وجود دارد که امکان مشاهده بافت‌های زنده یا تثبیت شده گیاهی، جانوری و پروکاریوت‌ها را فراهم می‌کند. قبل از مشاهده نمونه زیر این میکروسکوپ باید رنگ‌آمیزی شود.
• میکروسکوپ نوری فاز کنتراست: از این میکروسکوپ برای مشاهده نمونه‌های بافتی رنگ نشده استفاده می‌شود. در میکروسکوپ فاز کنتراست، کاربر نمونه‌ای روشن در زمینه تیره مشاهده می‌کند. به کمک این میکروسکوپ می‌توان مورفولوژی سلول‌های گیاهی و جانوری زنده، حرکت باکتری‌ها و ساختارهای داخلی باکتری مثل اندوسپور را مشاهده کرد. این میکروسکوپ در مطالعات بافت شناسی کاربرد کمتری دارد.
• میکروسکوپ نوری زمینه تیره: ساختار و میکروسکوپ زمینه تیره شباهت زیادی به مکیروسکوپ‌های فاز کنتراست دارد. از این میکروسکوپ‌ها برای مشاهده سلول‌های زنده و رنگ نشده استفاده می‌شود. زیر این میکروسکوپ نمونه روشن در زمینه تیره مشاهده می‌شود. با استفاده از این میکروسکوپ می‌توان اندامک‌های سلول‌های یوکاریوتی و مورفولوژی باکتری‌ها را بررسی کرد و کاربرد کمتری در بافت‌شناسی دارد.
• میکروسکوپ نوری فلورسنت: در این میکروسکوپ برخلاف سایر میکروسکوپ‌های نوری منبع نور وجود ندارد و تابش پرتوی فلورسنت از نمونه پس از عبور از عدسی‌ها تصویر را تشکیل می‌دهد. نمونه این میکروسکوپ‌ها به‌وسیله رنگ‌های فلورسنت نشان‌دار می‌شوند. رنگ‌های فلورسنت مولکول‌های شیمیایی هستند که با دریافت انرژی طول موج فرابنفش، بنفش یا آبی، الکترون لایه ظرفیت آن‌ها برانگیخته شده و برای برگشت به حالت پایدار انرژی خود را به شکل پرتو نور ناحیه مرئی آزاد می‌کنند. از این میکروسکوپ بیشتر برای بررسی ساختاهارهای ویژه در بافت‌های جانوری و باکتری‌ها استفاده می‌شود.

میکروسکوپ الکترونی

اساس تشکیل تصویر در میکروسکوپ‌های الکترونی برهم‌کنش پرتوالکترونی با ساختارها و مولکول‌های نمونه است. به کمک این دستگاه می‌توان نمونه‌های بسیار نازک (۱۰ تا ۱۰۰ نانومتری) بافت، نمونه‌های مرده، بلورهای معدنی یا پلیمرهای شیمیایی را بررسی کرد. الکترون آزاد شده از منبع در این دستگاه به‌وسیله دو دسته عدسی‌های کاندنسور بر روی نمونه متمرکز می‌شود.

بخش‌های متراکم نمونه پرتو الکترونی را بیشتر پراکنده می‌کنند و در تصویر حاصل ایجاد شده تیره‌تر مشاهده می‌شوند. اما بخش‌های شفاف‌تر به دلیل جذب بیشتر الکترون‌ها روشن‌تر دیده می‌شوند. عدسی شیئی پرتوی خروجی از نمونه را بزرگ‌نمایی می‌کند و تصویر پس از عبور از عدسی‌های چشمی روی صفحه فلورسنت تشکیل می‌شود. زیر صفحه فلورسنت دوربینی وجود دارد که تصویر را برای مشاهده کاربر به سیستم کامپیوتری منتقل می‌کند. میکروسکوپ‌های الکترونی نگاره یا روبشی (Transmission Electron Microscope | TEM) تصویری از سطح نمونه و میکروسکوپ‌های الکترونی گذاره یا عبوری ( Scanning Electron Microscope | SEM) تصویری از ساختارهای داخلی نمونه در اختیار کاربر قرار می‌دهد.

ایمونوهیستوشیمی چیست ؟

«ایمونوهیستوشیمی» (Immunohistochemistry | IHC) یکی از روش‌های رنگ‌آمیزی با استفاده از آنتی‌بادی‌ها (ایمونو) است که در بافت شناسی (هیستو) کاربرد دارد. از این روش برای شناسایی شاختار پروتئینی خاص در بافت‌های سالم یا آسیب‌دیده استفاده می‌شود. این روش رنگ‌آمیزی در بررسی بافت توموری (برای شناسایی آنتی‌ژن توموری) و تحقیقات پایه (برای شناسایی تغییر بیان پروتئین‌ها یا واکنش‌های بیوشیمیایی) کاربرد زیادی دارد. نمونه‌های این بافت را می‌توان با روش‌های معمول بافت‌شناسی که در بخش‌های قبلی توضیح دادیم، آماده و با میکروسکوپ فلورسنت مشاهده کرد.

آنتی‌بادی‌های این روش رنگ‌آمیزی به یک آنزیم (کروموژنیک هیستولوژی) یا مولکول فلورسنت (ایمونوفلورسنت) متصل می‌شوند.

• کروموژنیک هیستولوژی: در این روش آنتی‌بادی به آنزیمی (ازجمله پرواکسیداز یا آلکالین فسفاتاز برای شناسایی پروتئین‌ها) متصل می‌شود که محصول فعالیت آن ماده‌ای رنگی است.
• ایمونوفلورسنت: در این روش آنتی‌بادی به یک فلوروفور (ماده فلورسنت) مثل فلورسین یا رودامین متصل می‌شود.

آنتی بادی ایمونوهیستوشیمی

آنتی‌بادی‌هایی که در روش‌های ایمونوهیستوشیمی استفاده می‌شوند را بر اساس روش تهیه به دو نوع مونوکلونال یا پلی‌کولونال و بر اساس روش استفاده از آن‌ها به دو نوع اولیه یا ثانویه تقسیم‌بندی می‌کنیم.

• آنتی‌بادی مونوکلونال: برای تهیه این آنتی‌بادی‌ها پروتئین یا پپتید هدف را به حیوان آزمایشگاهی تزریق و از بافت ایمنی نمونه‌برداری می‌کنند. در نتیجه تمام آنتی‌بادی‌‌ها از یک رده سلول والد تولید و فقط به اپیتوپ هدف متصل می‌شوند.
• آنتی‌بادی پلی‌کولونال: برای تهیه این آنتی‌بادی‌ها پروتئین یا پپتید نمونه را به خیوانات آزمایشگاهی تزریق و پس از پاسخ ایمنی ثانویه، آنتی‌بادی تولید شده را از سرم کامل جانور استخراج می‌کنند. در نتیجه این مخلوط آنتی‌بادی ناهمگون آنتی‌ژن‌های مختلفی را شناسایی می‌کند.
• آنتی‌بادی اولیه: این آنتی‌بادی مستقیم به آنتی‌ژن هدف متصل می‌شود و معمولا نشانه‌دار (رنگ فلورسنت یا آنزیم) نیست.
• آنتی‌بادی ثانویه: این آنتی‌بادی، آنتی‌بادی اولیه را شناسایی می‌کند و معمولا نشانه‌دار است.

کتاب های مرجع بافت شناسی

بافت شناسی و آناتومی دو مبحث مهم در رشته پزشکی و شاخه‌های مختلف زیست شناسی است. آشنایی با کتاب‌های مرجعی که مطالب دشوار این رشته را علاوه بر بیان ساده با تصاویر کاربردی، واضح و رنگی تسهیل می‌کند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. به همین دلیل در این بخش دو کتاب مرجع مهم برای مطالعه بافت شناسی را معرفی می‌کنیم.

کتاب بافت شناسی جان کوئیرا

کتاب «بافت شناسی پایه جان‌کوئیرا» (junqueira’s basic histology) یکی از معتبرترین کتاب‌های آموزش بافت‌شناسی است که با ادبیات ساده و تصاویر واضح ساختارهای بافتی یدن انسان را آموزش می‌دهد. این کتاب در ۲۳ فصل تالیف شده است. در فصل اول کتاب مفهوم بافت‌شناسی، ابزارها و روش‌های لازم برای مطالعه این شاخه از زیست‌شناسی توضیح داده می‌شود.

نویسنده در دو فصل بعدی به توضیح ساختارهای داخلی سیتوپلاسم (فصل ۲) و هسته (فصل ۳) می‌پردازد و کتاب با توضیح بافت‌های پوششی (فصل ۴)، پیوندی (فصل ۵)، چربی (فصل ۶)، غضروف (فصل ۷)، استخوان (فصل ۸)، بافت و دستگاه عصبی (فصل ۹)، ماهیچه‌‌ای (فصل ۱۰)، دستگاه گردش خون (فصل ۱۱)، خون (فصل ۱۲)، خون‌سازی (فصل ۱۳)، سیستم ایمنی و اندام‌های لنفی (فصل ۱۴)، لوله گوارش (فصل ۱۵)، اندام‌های کمک‌کننده لوله گوارش (فصل ۱۶)، سیستم تنفسی (فصل ۱۷)، پوست (فصل ۱۸)، سیستم ادراری (فصل ۱۹)، غدد اندوکرین (فصل ۲۰)، سیستم تولید مثلی مردان (فصل ۲۱)، سیستم تولید مثلی زنان (فصل ۲۲) و اندام‌های حواس ویژه (فصل ۲۳) ادامه می‌یابد. در بخش ضمائم کتاب انواع روش‌های رنگ‌آمیزی سلول برای مطالعات میکروسکوپی توضیح داده شده است.

کتاب بافت شناسی سلیمانی راد

کتاب بافتی شناسی نوشته دکتر جعفر سلیمانی راد یکی دیگر از کتاب‌های مرجع برای آموزش بافت‌شناسی است. این کتاب در ۲۰ فصل و با تصاویر رنگی تالیف شده است. بیان ساده و تصاویر رنگی این کتاب درک ساختارهای سلولی، مفاهیم بافت‌شناسی، تکنیک‌های بررسی بافت و سازمان‌یافتگی بافت‌ها در اندام‌های مختلف را تسهیل می‌کند.

نویسنده در فصل اول این کتاب اهمیت بافت‌شناسی و روش‌های مطالعه بافت را توضیح می‌دهد و کتاب با آموزش بیولوژی سلولی (فصل ۲)، بافت پوششی (فصل ۳)، بافت همبند (فصل ۴)، غضروف (فصل ۵)، استخوان (فصل ۶)، بافت عضلانی (فصل ۷)، خون و خونسازی (فصل ۸)، دستگاه گردش خون و لنف (فصل ۹)، بافت عصبی (فصل ۱۰)، دستگاه ایمنی (فصل ۱۱)، پوست (فصل ۱۲)، دستگاه گوارش (فصل ۱۳)، پانکراس و کبد (فصل ۱۴)، دستگاه تنفس (فصل ۱۵)، کلیه و دستگاه ادراری (فصل ۱۶)، سیستم اندوکرین (فصل ۱۷)، دستگاه تناسلی زن (فصل ۱۸)، دستگاه تناسلی مرد (فصل ۱۹) و چشم و گوش (فصل ۲۰) ادامه می‌یابد. این کتاب در مقایسه با بافت شناسی جان کوئیرا به جزئیات کمتری می‌پردازد.

تفاوت هیستولوژی و پاتولوژی چیست ؟

بافت شناسی (هیستولوژی) و آسیب‌شناسی، پاتولوژی یا پاتوهیستولوژی دو علم برای بررسی ساختارهای بافتی هستند. با این تفاوت که در بافت شناسی سازمان‌یافتگی و عملکرد بافت‌های سالم و در پاتولوژی سازمان‌یافتگی و تغییرات بافت‌های آسیب‌دیده بررسی می‌شود. پاتولوژی این امکانم را فراهم می‌کند که متخصصی رشته‌های مختلف پزشکی میزان آسیب یک بافت در بیماری‌های مختلف (برای مثال انواع تومورها)، اثر درمان و نوع بیماری (تشخیص تومور پس از جراحی) را مشخص کنند.

جمع بندی

در این مطلب توضیح دادیم که بافت شناسی شاخه‌ای از علم زیست‌شناسی است که ساختار و عملکرد بافت‌های موجودات پرسلولی را بررسی می‌کند. به علاوه تکنیک‌های بافت‌شناسی به بررسی تغییرات مورفولوژی و متابولیکی ایجاد شده بر اثر بیماری‌ها یا درمان‌های کمک می‌کند. میکروسکوپ (نوری و الکترونی) و روش‌های رنگ‌آمیزی دو ابزار اصلی این رشته برای مطالعه بافت‌ها هستند.