توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) یک فناوری توالی‌یابی موازی گسترده است که توان عملیاتی، مقیاس‌پذیری و سرعت بسیار بالایی را ارائه می‌دهد. این فناوری برای تعیین ترتیب نوکلئوتیدها در کل ژنوم یا مناطق هدف DNA یا RNA استفاده می شود. توالی یابی انبوه موازی یا نسل بعدی (NGS) به طور چشمگیری هم حوزه تحقیقاتی و هم حوزه تشخیصی را در سال های اخیر تغییر داده است. این امکان توصیف دقیق مناظر ژنومی بسیاری از سرطان ها را فراهم کرده است و به جداسازی ژن عامل در بسیاری از بیماری های ارثی مندلی کمک کرده است.
NGS مجموعه‌ای بسیار انعطاف‌پذیر از تکنیک‌ها و رویکردها است و می‌تواند با موارد زیر سازگار شود:
- تغییرات توالی در کل ژنوم، اگزوم یا هر زیر مجموعه آن (DNA)،
- ارائه اطلاعات شماره کپی DNA،
- توالی کل رونوشت (RNA رونویسی شده) یا هر زیر مجموعه ای از آن
- شناسایی جابجایی ها،
- نشان دادن سطح بیان ژن،
- استفاده از مواد تازه یا FFPE،
اما نیاز به تفسیر بیوانفورماتیک پیچیده دارد و نیازهای ذخیره سازی داده گسترده ای دارد.
NGS از تکنیک‌های ترکیبی یا مبتنی بر آمپلیکون برای تعیین توالی DNA یا RNA (که قبلاً به cDNA رونویسی شده بود) استفاده می‌کند. این تکنیک می تواند از کل ژنوم (همه ~ 3 میلیارد جفت باز) تا همه ژن های کد کننده (exome؛ ~ 1٪ از ژنوم یا ~ 30 میلیون جفت باز – یعنی 20000 ژن متشکل از 180000 اگزون) تا همه RNA رونویسی شده از ژن ها (ترانسکریپتوم) و هر زیر مجموعه ای از آنها شناسایی کند. بنابراین از نظر ظرفیت بسیار از رویکردهای قبلی پیشی می‌گیرد و احتمالاً در آینده نزدیک به آزمایش مولکولی کمک می‌کند. این تکنیک از DNA تکه تکه‌شده برای ساخت یک کتابخانه توالی‌یابی استفاده می‌کند و سپس میلیون‌ها رشته DNA منفرد به طور همزمان توالی‌یابی می‌شوند. بسته به رویکرد می توان از شیمی های مختلفی استفاده کرد، اما همه از یک ریزتراشه سیلیکونی برای ضبط همزمان توالی ها استفاده می کنند. سپس تمام توالی‌های تعیین‌شده با استفاده از الگوریتم‌های پیچیده رایانه‌ای در برابر ژنوم مرجع پذیرفته‌شده برای شناسایی تفاوت‌ها تراز می‌شوند. از آنجایی که بخش های DNA توالی یابی شده جداگانه به طور جداگانه در یک راستا قرار می گیرند، کمیت جهش ها (فرکانس های آللی) را می توان بسیار دقیق تعیین کرد. هنگامی که توالی یابی گسترده (فراتر از تنها چند ژن) در سرطان انجام می شود، اغلب لازم است DNA طبیعی (غیر نئوپلاستیک) استخراج شده از لنفوسیت ها یا سایر بافت های طبیعی برای مقایسه و شناسایی تغییرات خاص فرآیند نئوپلاستیک توالی یابی شود.
- تفاوت بین NGS و Sanger Sequencing
در اصل، مفاهیم پشت فن‌آوری‌های سنگر و توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) مشابه هستند. در هر دو توالی یابی NGS و Sanger (همچنین به عنوان توالی یابی دی اکسی یا الکتروفورز مویرگی نیز شناخته می شود)، DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای فلورسنت را یک به یک به یک رشته الگوی DNA در حال رشد اضافه می کند. هر نوکلئوتید ترکیب شده با برچسب فلورسنت خود شناسایی می شود.
تفاوت اساسی بین توالی یابی Sanger و NGS حجم توالی یابی است. در حالی که روش سنگر فقط یک قطعه DNA را در یک زمان توالی‌بندی می‌کند، NGS به طور گسترده موازی است و میلیون‌ها قطعه را به طور همزمان در هر اجرا توالی‌بندی می‌کند. این فرآیند به تعیین توالی صدها تا هزاران ژن در یک زمان تبدیل می شود. NGS همچنین قدرت کشف بیشتری برای تشخیص انواع جدید یا نادر با توالی‌یابی عمیق ارائه می‌دهد.
- مزایای توالی NGS در مقابل Sanger
مزایای NGS عبارتند از:
حساسیت بالاتر برای تشخیص انواع فرکانس پایین
زمان چرخش سریعتر برای حجم نمونه بالا
پوشش ژنومی جامع
حد پایین تشخیص
ظرفیت بالاتر با مالتی پلکس نمونه
توانایی توالی یابی صدها تا هزاران ژن یا ناحیه ژنی به طور همزمان
- مزایای فناوری RNA-Seq در مقابل میکروآرایه
توانایی تشخیص رونوشت های جدید: برخلاف آرایه ها، فناوری RNA-Seq به پروب های خاص گونه یا رونوشت نیاز ندارد. می‌تواند رونوشت‌های جدید، همجوشی‌های ژنی، انواع تک نوکلئوتیدی، ایندل‌ها (درج‌ها و حذف‌های کوچک) و سایر تغییرات ناشناخته قبلی را که آرایه‌ها نمی‌توانند تشخیص دهند، شناسایی کند.
محدوده دینامیکی گسترده تر: با فناوری هیبریداسیون آرایه، اندازه گیری بیان ژن توسط پس زمینه در انتهای پایین و اشباع سیگنال در انتهای بالا محدود می شود. فناوری RNA-Seq تعداد خواندن توالی دیجیتالی گسسته را تولید می‌کند و می‌تواند بیان را در محدوده دینامیکی بزرگ‌تر تعیین کند (بیش از 105 برای RNA-Seq در مقابل 103 برای آرایه‌ها).
ویژگی و حساسیت بالاتر: در مقایسه با ریزآرایه‌ها، فناوری RNA-Seq می‌تواند درصد بالاتری از ژن‌های بیان شده متفاوت، به‌ویژه ژن‌هایی با بیان کم را شناسایی کند.
تشخیص ساده رونوشت های کمیاب و کم فراوان: عمق پوشش توالی یابی را می توان به راحتی افزایش داد تا رونوشت های نادر، رونوشت های منفرد در هر سلول، یا ژن هایی با بیان ضعیف
- تفاوت بین NGS و qPCR
هنگام مقایسه توالی یابی نسل بعدی (NGS) در مقابل فناوری های qPCR، تفاوت اصلی قدرت کشف است. در حالی که هر دو نوع تشخیص بسیار حساس و قابل اعتماد را ارائه می دهند، qPCR فقط می تواند توالی های شناخته شده را تشخیص دهد. در مقابل، NGS یک رویکرد بدون فرضیه است که نیازی به دانش قبلی از اطلاعات توالی ندارد. NGS قدرت اکتشاف بالاتری را برای شناسایی ژن‌های جدید و حساسیت بالاتری برای تعیین کمیت انواع نادر و رونوشت‌ها فراهم می‌کند.
فناوری‌های NGS در مقابل qPCR نیز در مقیاس‌پذیری و توان عملیاتی متفاوت هستند. در حالی که qPCR برای تعداد هدف کم موثر است، گردش کار می تواند برای چندین هدف دشوار باشد. NGS برای مطالعات با اهداف یا نمونه های زیاد ترجیح داده می شود. یک آزمایش NGS می تواند انواع مختلفی را در هزاران منطقه هدف با وضوح تک پایه شناسایی کند.
مزایای qPCR:
شرایط کار آشنا
تجهیزات مورد نیاز این تکنیک در حال حاضر در اکثر آزمایشگاه ها قرار داده شده است
چالش های qPCR:
فقط می تواند مجموعه محدودی از نوکلوتید ها را بررسی کند
عملاً قدرت کشف وجود ندارد
مقیاس پذیری پایین
مزایای NGS:
قدرت کشف بالاتر*
توان نمونه بالاتر
چالش های NGS:
مقرون به صرفه تر برای توالی یابی تعداد کم اهداف (1 تا 20 هدف)
زمان بر برای توالی یابی تعداد کم اهداف (1 تا 20 هدف)
- توالی نسل بعدی شامل چهار مرحله است:
(الف) آماده سازی کتابخانه،
(ب) تولید خوشه،
(ج) توالی،
(د) هم ترازی و تجزیه و تحلیل داده ها.
