رده های سلولی انسانی

رده سلولی: انواع، نامگذاری، انتخاب و نگهداری

توسعه و جنبه های مختلف دیگر کشت اولیه در بالا شرح داده شده است. اصطلاح رده سلولی به گسترش کشت پس از اولین ساب کالچر اشاره دارد. به عبارت دیگر ، هنگامی که کشت اولیه ساب کالچر می شود (زیر کشت می رود)، به یک رده سلولی تبدیل می شود. یک رده سلولی مشخص شامل چندین دودمان سلول با فنوتیپ های مشابه یا مجزا است.

می توان از طریق شبیه سازی (کلون) یا جداسازی فیزیکی سلول یا روش های انتخابی دیگر، دودمان سلولی خاصی را انتخاب کرد. از چنین رده سلولی که حاصل از انتخاب یا کلون کردن باشد به عنوان سویه سلولی یاد می شود. سویه های سلولی تا ابد زنده نمی مانند ، زیرا پس از برخی تقسیمات از بین می روند.

امروزه رده های سلولی استاندارد با نام های متفاوت و مربوط به بافت های مختلفی در سرتاسر دنیا وجود دارند. اما رده سلولی چیست؟ و چه زمانی به یک سلول تحت کشت عنوان رده سلولی یا cell line اطلاق می شود؟

در گذشته آنچه که یک سلول را تبدیل به رده سلولی می کرد، توانایی بالای رشد آن بود. یعنی زمانی که از یک بافت سرطانی با قدرت رشد بالا سلول استخراج می شد یا سلولی که از یک بافت نرمال استخراج شده بود تحت شرایط خاصی (تیمار با ویروس های انکوژنیک) تبدیل به سلول سرطانی شده و در نهایت یک رده سلولی با قدرت پاساژ نامحدود از آن ساخته می شد.

همچنین سایر سلول ها با قدرت رشد کمتر با عناوینی مثل کشت اولیه (primary culture) و سل استراین (cell strain) شناخته می شدند. اما امروزه سلول های تحت کشت به دو دسته کشت اولیه (primary culture) و کشت ثانویه (secondary culture) تقسیم می شوند. یعنی زمانی که یک سلول از whole organism استخراج می شود و در شماره پاساژ 1 می باشد تحت عنوان کشت اولیه شناخته می شود.

در ادامه فارغ از اینکه پتانسیل life span سلول چقدر است و تا چه تعداد پاساژ را تحمل می کند، به محض اینکه وارد پاساژ 2 شود به عنوان کشت ثانویه یا cell line شناخته می شود. حال می توان گفت که تعداد رده های سلولی در دنیا نامحدود می باشد و هر شخصی می تواند رده سلولی خود را تولید کند. اما تولید رده سلولی استاندارد به همین سادگی ها نیست. یک رده سلولی استاندارد باید ویژگی های مشخصی داشته باشد و از طرفی باید تمام مشخصات آن آنالیز شود.

به عنوان مثال باید اطلاعات کاریوتایپ، آلودگی با ویروس های مختلف، ایزوآنزیم ها، محیط کشت مورد نیاز، مشخصات اهدا کننده و … مشخص شده و در شناسنامه رده سلولی گزارش شود.

همچنین سلول هایی که نامزد رده سلولی می شوند یا باید توانایی رشد بالایی داشته باشند یا یک منبع مشخص با متد استخراج استاندارد داشته و همچنین تست های شناسایی مشخصی برای آن ها تعریف شود.

به شکل کلی می توان گفت اکثر سلول های سرطانی و جنینی که توانایی رشد بالایی دارند، به شکل cell line استاندارد قابل خریداری هستند و سلول های بنیادی عموماً به عنوان یک رده سلولی استاندارد استخراج شده و پس از انجام تست های تاییدی مورد استفاده قرار می گیرند.

به عنوان مثال همه موش BALB/c را به عنوان یک موش Inbred و با سیستم ایمنی ضعیف برای انجام پروژه های آلوگرافت می شناسند. اما باید توجه کرد موش بالب سی به عنوان یک موش هم خون مجموعه از حیوانات شبیه به هم با درصد شباهت 99.99 درصد ژنتیکی به وجود می آورد. این امر تکرار پذیری آزمایش هایی که بر روی این نوع موش انجام می شود را امکان پذیر می کند. کار کردن بر روی رده های سلولی هم همچین شرایطی را بوجود می آورد و داده هایی حاصل شده از یک پژوهش خاص در یک نقطه جغرافیایی، قابل تکرار در نقاط جغرافیایی دیگر خواهد بود.

تاریخچه رده های سلولی

همانطور که گفته شد اولین رده سلولی که در دنیا استخراج شد و دانشمندان توانستند آن را به شکل پیوسته کشت دهند، سلول های بافت کارسینومای دهانه رحم یک خانم سیاه پوست به نام Henrietta Lacks در اواخر سال 1951 در آزمایشگاه دگتر مارگارت و دکتر گی استخراج شده و در سال 1952 تحت عنوان رده سلولی HeLa شناخته شد.

خانم Lacks که در سال 1951 به خاطر بیماری خود دنبال درمان بود و به بیمارستان جانز هاپکینز مراجعه کرده بود، بدون اینکه اجازه‌ای از خودش گرفته شود، از بافت او سلول استخراج شد. خانم Lacks در اثر بیماری سرطان در سن 32 سالگی فوت کرد.

اگرچه خود خانم Lacks هیچ گاه خبر نداشت و هیچ گرنتی به خانواده او تعلق نگرفت، اما رده های سلولی استخراج شده از او، در طی 70 سال گذشته جان هزاران نفر را نجات داده و بیش از 100 هزار مقاله را به خود اختصاص داده است.

یکی از اولین تحقیقاتی که به واسطه رده سلولی HeLa انجام شد مربوط به سال 1353 بود که دانشمندی به نام یوناس سالک، واکسن فلج اطفال را تولید کرد. در سال 1956 به واسطه همین سلول ها اثر تشعشعات X-Ray بر روی سلول های انسانی و اثر جهش پذیری آن مشخص شد.

همچنین در همین سال ها مطالعات مربوط به سرطان به شکل جدی توسعه یافته و پیشرفت های چشمگیری را تا دهه 70 قرن 20 نشان داد. حتی پاساژ هایی از سلولی های HeLa به فضا فرستاده شده و حیات آن ها در حیات مورد بررسی قرار گرفت.

اهمیت استفاده از رده سلولی استاندارد

یکی از سوالاتی که برای اکثر پژوهشگران به وجود می آید، این است که چرا باید روی رده های سلولی استاندارد کار کرد؟ رده های سلولی استاندارد عموماً سرطانی بوده و در طی سالیان زیادی (اکثرا قریب به نیم قرن) که کشت داده شده‌اند، متحمل جهش ها و تغییرات زیادی شده‌اند و بدین ترتیب اگرچه نام استاندارد را با خود یدک می کشند اما این تغییرات باعث فاصله زیاد آن ها با سلول های انسانی شده است.

یکی از مسائلی که در پژوهش ها باید به آن توجه نمود و این مسئله اگرچه مهجور مانده اما یکی از معیار های اساسی هر پژوهشی می باشد، توجه به قابلیت نرمال سازی داده ها در سطح جهانی می باشد.

در طی سالیان اخیر و دهه های گذشته، سلول های HeLa در زمینه شناسایی عفونت های باکتریایی، ویروسی، مطالعات سرطان، پیری و تولیدات بر پایه سلولی کاربرد های بسیاری پیدا کرد. موازی با همین مطالعات، روز به روز رده های سلولی دیگری به مجموعه بانک های سلولی افزوده شده و تا کنون بیش از 4000 رده سلولی استاندارد به بانک سلولی ATCC افزوده شده و در حال فروش است.

رده های سلولی استاندارد

فروش رده های سلولی جانوری-استاندارد ATCC

رده های سلولی به عنوان یک درگاه ورودی به دنیای in-vitro شناخته شده و برای انجام تست های سلولی قابل قبول در سطح دنیا باید از رده های سلولی استاندارد استفاده نمود. اولین رده سلولی تولید شده دنیا با نام HeLa شناخته شده و پس از آن هزاران رده استخراج و به آن ها اضافه شده است.

انواع رده های سلولی

• رده سلولی محدود(میرا):

سلولهای موجود در کشت قبل از اینکه سرعت رشد آنها کاهش یافته و در نهایت از بین بروند ، به تعداد محدودی تقسیم می شوند. به رده های سلولی با طول عمر کشت محدود، رده های سلولی محدود (finite cell lines) گفته می شود. سلولها به طور معمول قبل از مرگ، ۲۰ تا ۱۰۰ بار تقسیم می شوند (یعنی ۲۰-۱۰۰ بار جمعیت دو برابر می شود). تعداد واقعی دو برابر شدن آنها به گونه، تفاوت دودمان سلولها ، شرایط کشت و غیره بستگی دارد. سلولهای انسانی معمولاً ۵۰-۱۰۰ بار تقسیم می شوند ، در حالی که سلولهای موش قبل از مرگ ۳۰-۵۰ بار تقسیم می شوند.

• رده سلولی ماندگار(نامیرا):

تعداد کمی سلول در کشت ممکن است مورفولوژی متفاوتی پیدا کنند و تغییر یابند. چنین سلولهایی قادر به رشد سریعتر و در نتیجه کشت مستقل هستند. سلول های حاصل از این سلولهای تغییر یافته، عمر نامحدود دارند (بر خلاف سویه های سلولی منشأ آنها). به این رده سلولی نامیرا گفته می شود. این رده های سلولی، فنا ناپذیر و تومورزا هستند. سلولهای تبدیل شده به رده سلولی نامیرا را می توان از طریق کشت سلولهای نرمال (یا سویه های سلولی) با تیمار آنها با مواد شیمیایی سرطان زا یا با آلوده کردن به ویروس های آنکوژنیک به دست آورد. در جدول ۳۶٫۱ ، خصوصیات مختلف رده های سلولی میرا و رده های سلولی نامیرا مقایسه شده است.

در زیر بیشترین اصطلاحاتی که در هنگام کار استفاده می شود توضیح داده شده است.

• ضریب تقسیم:

تقسیم کردن نسبت رقت یک کشت سلولی در ساب کالچر. به عنوان مثال ، وقتی هر ساب کالچر، کشت را به دو قسمت تقسیم می کند ، ضریب تقسیم ۱: ۲ است.

• تعداد پاساژ:

تعداد دفعاتی است که کشت، ساب کالچر شده است.

• تعداد نسل:

 به معنی تعداد دو برابر شدن جمعیت سلول است. باید توجه داشت که تعداد پاساژ و تعداد نسل یکسان نیستند و کاملاً متفاوت هستند.

• نامگذاری

نامگذاری یا دادن کد به رده های سلولی برای شناسایی آنها یک عمل رایج است. به عنوان مثال ، کد NHB 2-1 نشانگر رده سلولی طبیعی مغز انسان است و به دنبال آن سویه سلولی (یا شماره رده سلولی) ۲ و شماره کلون ۱ وجود دارد. در یک آزمایشگاه کشت معمولا کتاب راهنما یا فایل های پایگاه داده روی کامپیوتر، برای هر یک از رده های سلولی وجود دارد.

ضمنا نام گذاری رده های سلولی و اطمینان از منحصر به فرد بودن آنها برای تعیین رده های سلولی کاملاً ضروری است تا در هنگام ارائه گزارش در مقالات، سردرگمی ایجاد نشود. بعلاوه ، در زمان انتشار ، رده سلولی باید با کد مشخص شده آزمایشگاهی که از آن بدست آمده است، پیشوند شود. NCI برای موسسه ملی سرطان ، Wl برای ویستر انستیتو.

• رده های سلولی پر کاربردتر:

هزاران رده سلولی از آزمایشگاههای مختلف در سراسر جهان وجود دارد. لیست انتخاب شده ای از برخی از رده های سلولی که معمولاً استفاده می شوند همراه با منشأ ، مورفولوژی و ویژگی های دیگر در جدول ۳۶٫۲ آورده شده است

• انتخاب رده های سلولی

هنگام انتخاب یک رده سلولی باید چندین فاکتور در نظر گرفته شود. برخی از آنها به طور خلاصه شرح داده شده است:

1. گونه ها:

به طور کلی ، رده سلولی غیر انسانی کمتر در معرض خطرهای زیستی هستند ، از این رو ترجیح داده می شوند. با این حال ، هنگام مقایسه کردن داده ها با انسان ، باید تفاوت گونه ها در نظر گرفته شود.

2. سلول میرا یا نامیرا:

کشت با رده سلولی نامیرا ترجیح داده می شوند زیرا سریعتر رشد می کنند، کلون کردن و نگهداری آنها آسان است و بازده بیشتری دارند. اما در اینکه رده های سلولی نامیرا عملکرد درست و مناسب سلول ها را بیان می کنند، جای تردید است. بنابراین ، برخی افراد استفاده از رده های سلولی میرا را پیشنهاد می دهند ، اگرچه کار دشواری است.

3. سلولهای نرمال یا تغییر یافته:

سلولهای تغییر یافته (ترنسفورم) ترجیح داده می شوند زیرا جاودانه اند و به سرعت رشد می کنند.

4. در دسترس بودن:

در دسترس بودن نیز مهم است. گاهی اوقات ممکن است لازم باشد که یک رده سلول خاص در آزمایشگاه ایجاد شود.

5. ویژگی های رشد:

پارامترهای رشد زیر باید در نظر گرفته شود:

• زمان دو برابر شدن جمعیت
• توانایی رشد در سوسپانسیون
• غلظت اشباع (بازده در هر فلاسک)
• بازده کلون

6. پایداری:

پایداری رده سلولی به طور خاص در کلون کردن و تولید ذخیره کافی مهم است.

7. حالت فنوتیپ:

مهم است که رده های سلولی دارای سلول هایی با بیان فنوتیپی مناسب باشند.

• نگهداری از کشت های سلولی:

برای نگهداری مناسب از رده های سلولی در کشت (کشت اولیه یا ساب کالچر) بررسی مورفولوژی سلول و تغییر دوره ای محیط کشت بسیار مهم است.

• مورفولوژی سلول:

سلولهای موجود در کشت باید مرتباً مورد بررسی قرار گیرند تا وضعیت سلامتی سلولها ، عدم وجود آلودگی و سایر فاکتور ها (سموم موجود در محیط ، مواد مغذی ناکافی و غیره) بررسی شود.

• جایگزینی محیط کشت:

برای حفظ رده های سلولی کشت شده، خواه سلولها در حالت تکثیر یا غیر تکثیر باشند ، تعویض دوره ای محیط کشت مورد نیاز است. برای سلولهای در حالت تکثیر ، در مقایسه با سلول هایی که تکثیر نمیکنند، محیط باید مرتباً تغییر کند. فاصله زمانی بین تعویض محیط کشت به سرعت رشد سلول و متابولیسم بستگی دارد.

به عنوان مثال ، برای سلولهای تغییر یافته با سرعت رشد بالا (به عنوان مثال HeLa) ، محیط کشت را باید دو بار در هفته تعویض کنند ، در حالی که برای سلولهای تغییر شکل نیافته با رشد کند (به عنوان مثال IMR-90) محیط کشت ممکن است یک بار در هفته تعویض شود. بعلاوه ، برای سلولهای در حال تکثیر با سرعت بالا، باید بیشتر از سلولهای کند ساب کالچر انجام شود.

برای تعویض محیط کشت باید عوامل زیر را در نظر گرفت:

1. غلظت سلول:

کشتهایی که غلظت سلولی بالایی دارند سریعتر از کشت های با غلظت پایین، از مواد مغذی محیط استفاده می کنند. از این رو لازم است که محیط کشت بیشتر از قبل تغییر کند.

2. کاهش pH:

افت PH محیط نشانگر تغییرات محیط کشت است. اکثر سلول ها می توانند در pH 7.0 رشد خوبی داشته باشند و تقریباً با کاهش PH به ۶٫۵ رشد آنها متوقف می شود. با کاهش بیشتر pH  (بین ۶٫۵ تا ۶٫۰) ، سلول ها ممکن است بمیرند.

میزان افت pH به طور کلی برای هر رده سلولی با محیط کشت انتخابی تخمین زده می شود. اگر میزان افت کمتر از ۰٫۱ واحد pH در روز باشد ، حتی اگر بلافاصله محیط را تعویض نکنند ، سلول ها هیچ آسیبی نخواهند دید. اما هنگامی که میزان افت ۰٫۴ واحد pH در روز باشد ، محیط باید بلافاصله تعویض شود.

3. نوع سلول:

سلول های جنینی، سلول های تغییر یافته و رده های سلولی نامیرا به سرعت رشد می کنند و به ساب کالچر و تعویض محیط کشت مداوم نیاز دارند. در مقابل سلولهای طبیعی به آرامی رشد می کنند.

4. تغییرات مورفولوژی:

بررسی مکرر مورفولوژی سلول در تکنیک های کشت بسیار مهم است. هرگونه اشکال در مورفولوژی سلول ممکن است منجر به آسیب غیرقابل برگشت به سلول شود. تعویض محیط باید برای جلوگیری از خطر آسیب به سلول انجام شود.