منشا سلول های تک هسته ای خون محیطی
سلولهای تک هسته ای خون محیطی شامل لنفوسیت هایB ، لنفوسیت هایT ، سلول های کشنده ظبیعی و مونوسیت ها هستند که با استفاده از فایکول جدا شده و برای آزمایش های مختلف به کار برده می شوند. فایکول یک محلول استاندارد آزمایشگاهی بی رنگ و استریل است که برای جداسازی لنفوسیت های B،T در مطالعات آزمایشگاهی کاربرد دارد. یک ترکیب کربوهیدراتی شاخه دار و نسبت مناسبی از پودر فایکول و سدیم دیاتروزوات است که دانستیه نهایی آن ۱/۰۷۷ می باشد که برای جداسازی لنفوسیت ها از خون مناسب میباشد. جداسازی رده سلول های لنفوسیت از محتویات باقی مانده لکوسیتی با استفاده از گرادیان غلظتی ماده فایکول و سانتریفیوژ انجام می شود. اهمیت این ماده در حفظ بقا لنفوسیت ها و سطح پایین سمیت آن است.معمولا محلول های فایکول به صورت تجاری و آماده در دسترس قراد دارد.
سلول های تک هسته ای خون محیطی از سلول های بنیادی خونساز (HSC) که در مغز استخوان قرار دارند سرچشمه می گیرند. HSC ها از طریق فرایندی به نام خون سازی یا هماتوپوئز باعث تولید کلیه سلول های خونی و سیستم ایمنی بدن می شوند. سلول های بنیادی خونساز، از طریق خونسازی پیشرفت می كنند و سلول های میلوئیدی (مونوسیت ها، ماكروفاژها، گرانولوسیت ها، مگاكاریوسیت ها، سلول های دندریتی، گلبول های قرمز) و لنفوئید (سلول های T، سلول های B، سلول های NK) را تولید می كنند.
درون هر دو رده سلول هایی هستند که PBMC ها را تشکیل می دهند. PBMC ها سلول های خونی با هسته های گرد هستند که جمعیت سلول های ناهمگنی را شامل می شود که شامل جمعیت های مختلف لنفوسیت ها (سلول های T، سلول های B و سلول های NK)، سلول های دندریتیک و مونوسیت ها است. این سلول ها اجزای حیاتی سیستم ایمنی ذاتی و تطبیقی هستند که از بدن در برابر عفونت ویروسی، باکتریایی و انگلی محافظت کرده و سلول های توموری و مواد خارجی را از بین می برند.
فراوانی جمعیت های مختلف سلول ها در PBMC
جمعیت سلول های انسانی در هر فرد متفاوت است، اما به طور متوسط ، بیشتر PBMC ها را لنفوسیت ها تشکیل می دهند. لنفوسیت ها نقش اساسی در پاسخ های ایمنی سلولی و ایمنی هومورال دارند که در درجه اول، با فعال شدن سلول های T و B در ارتباط است.
در جمعیت لنفوسیت ها، سلول های CD3 + T مهمترین بخش سلولی (70-45٪) هستند. اکثر سلول های T به عنوان سلول های T ساده و در حال استراحت وجود دارند. این ها سلول های T هستند که توسط آنتی ژن فعال نشده اند و یا به عنوان سلول های T حافظه عمل می کنند. فعال شدن سلول های T ساده از طریق شناسایی آنتی ژن رخ می دهد و جمعیت کمی از سلول های T را در افراد سالم تشکیل می دهد. سلول های T پس از فعال شدن، یک پاسخ ایمنی سلولی را شروع می کنند که آنتی ژن های درون سلول آلوده یا بیمار را مورد هدف قرار می دهد.
به طور مشابه، سلول های CD19 + B به عنوان سلول های ساده یا حافظه ای وجود دارند که در انتظار فعال شدن توسط آنتی ژن هستند و فقط 5-15٪ از کل جمعیت لنفوسیت ها را تشکیل می دهند. سلول های B پس از فعال شدن، به سلول های پلاسما متمایز می شوند که قادر به ترشح آنتی بادی هایی هستند که به طور خاص آنتی ژن های آزاد گردش یافته در جریان خون را هدف قرار می دهند. توانایی هدف قرار دادن آنتی ژن های آزاد توسط آنتی بادی های ترشحی در فضای خارج سلول به عنوان پاسخ ایمنی هومورال تعریف می شود.
سلول های NK بخش کوچکتری از جمعیت لنفوسیت ها را تشکیل می دهند (5-10٪). این سلول ها بدون نیاز به آنتی ژن عملکرد موثر خود را انجام می دهند و از بدن در برابر فعالیت تومور دفاع می کنند.
بخش کوچکی از گلبول های سفید شامل سلول های دندریتیک (1-2٪) است که یک رابط حیاتی بین سیستم ایمنی ذاتی و سازگار را تشکیل می دهد. سلول های دندریتیک، یک سلول ارائه دهنده آنتی ژن بسیار تخصصی، آنتی ژن ها را بلعیده و قطعات آنتی ژنی را به سلول های سیستم ایمنی تطبیقی ارائه می دهد که باعث فعال شدن سلول های T و B می شود.
مونوسیت ها از نظر پیچیدگی و اندازه با لنفوسیت ها متفاوت اند.، مونوسیت ها (۱۰-۳۰٪) در جریان خون و بافت محیطی گردش می کنند و هنگامی که تحریک می شوند، بالغ می شوند و به سلول های دندریتیک یا ماکروفاژها متمایز می شوند که به عملکرد پاسخ های ایمنی ذاتی و اکتسابی کمک می کنند و به عنوان سلول های فاگوسیتیک و ارائه دهنده آنتی ژن عمل می کنند.
سلول های بنیادی خونساز از اهمیت بسیار بالایی برخوردارند. HSC ها در خون و مغز استخوان باعث تولید کلیه سلول های موجود در خون از جمله گلبول های قرمز خون، پلاکت ها، لنفوسیت ها، مونوسیت ها و گرانولوسیت ها می شوند. برای پیوند سلول های بنیادی، جمعیت این سلول نادر است و فقط 0.1-0.2٪ از بخش PBMC را تشکیل می دهد و جدا کردن آن ها از نمونه های خون کامل دشوار است.
جداسازی سلول های تک هسته ای خون محیطی
دو روش اصلی برای جداسازی سلول های تک هسته ای خون محیطی از خون کامل وجود دارد. به کمک استفاده از سانتریفوژ توسط ایجاد شیب تراکم یا با استفاده از لوکافر.
از آنجا که سلول ها دارای تراکم خاصی هستند، استفاده از فرآیند سانتریفیوژ با شیب تراکم، جمعیت سلول های اصلی مانند لنفوسیت ها، مونوسیت ها، گرانولوسیت ها و سلول های قرمز خون را از طریق ایجاد یک شیب تراکمی جدا می کند. برای سلول های انسانی، تراکم محیط 1.077 گرم در میلی لیتر امکان جداسازی کافی PBMC ها (تراکم 1.077 گرم در میلی لیتر) از سلولهای قرمز خون و گرانولوسیت ها (تراکم> 1.077 گرم در میلی لیتر) را فراهم می کند. پس از سانتریفیوژ، PBMC به عنوان یک لایه سفید نازک بین پلاسما و محیط ایجاد کننده شیب چگالی ظاهر می شود که جداسازی آن ها را آسان می کند.
دستگاه leukapheresis وسیله ای خودکار است که با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت بالا، PBMC را از خون کامل جدا می کند.
روش جداسازی سلولهای تک هسته ای خون محیطی
جهت استفاده از فایکول دقیقا طبق پروتوکل زیر مراحل کار را انجام دهید.قبل از باز کردن، محصول را به مدت یک الی دو دقيقه شیک کنید یا روی شیکر قرار بدید.
1- ابتدا حجم 5 میلی لیتر خون EDTA شده از هر نمونه را در فالكون تيوب 15میلی لیتری را با نسبت یک به یک (50%-50%) با 5 میلی لیتر PBS برای دریافت غلظت مناسب رقیق می کنیم . سپس دو تا سه بار فالكون را سرو ته می نمائیم.
2-مقدار 5 میلی لیتر محلول فايكول را در لوله مشابه دیگری ریخته و سپس بوسیله پیپت پاستور و پیپتور خون رقيق شده در مرحله قبل را به آهستگی و به شکلی که با محلول فايكول مخلوط نشود از کنار دیواره و به آرامی روی سطح فايكول می ریزیم. نكته: نباید خون رقیق شده با محلول فايكول تركيب شود و می بایست خون روی سطح فايكول قرار گیرد.
3- سپس فالكون را در سانتريفيوژ یخچال دار قرار داده با دمای 20 تا 18 درجه سانتیگراد و دور 2500 g و برای 15 الی 20 دقيقه سانتریفیوژ می کنیم تا لایه های مختلف براساس شيب چگالی جدا شوند. نكته: در صورتیکه از زمان خونگیری بیش از 2 ساعت گذشته باشد، می بایست مدت زمان سانتريفيوژ را افزایش داد.
4- پس از انجام سانتريفيوژ فالكون حاوی لایه های متمایز به ترتیب از بالا به پایین شامل : پلاسما (زردرنگ)، ( Buffy Coatحلقه شیری رنگ کدر)، فايكول ( شفاف) و گلبولهای قرمز (قرمز تیره )می باشد. بوسیله پیپت پلاستیکی یا سمپلر و با دقت کامل، حلقه شیری رنگ و کدر بین سرم و فايكول را جدا کرده و به لوله ای دیگر منتقل می کنیم. نكته: حلقه شیری رنگ کدر Buffy Coat حاوی سول های PBMC می باشد.
5- به نمونه Buffy Coat جدا شدہ تا حجم 10 ميلي ليتر ، PBSاضافه می کنیم
6-فالكون حاوی Buffy Coat وPBS را در دمای 4 تا 6 درجه سانتیگراد برای مدت 5 دقیقه و با دور 1400 rpm در سانتريفيوژ یخچال دار سانتریفیوژ می کنیم (مرحله شستشو)
7-مرحله شستشوی فوق را بار دیگر تکرار می كنيم.
8-سلولهای ته نشین شده را جداسازی کرده و برای انجام مراحل بعد به میکروتیوب های1/5میلی لیتری منتقل مي نماييم.
