از روش های آزمایشگاهی مرسوم جهت جداکردن مولکولهای باردار تکنیک ژل الکتروفورز (Gel Electrophoresis) میباشد .این جداسازی با توجه به اندازه، بار و جرم مولکولی آنها انجام میگیرد. فرایند کلی این تکنیک به این صورت است که با برقراری جریان در ژل الکتروفورز ، دو سمت ژل دارای دو قطب مخالف مثبت و منفی میشود که باعث میشود مولکول های باردار به سمت قطب مخالف خود حرکت کنند.این عمل حرکت مولکول ها تحت اصطلاح ” مهاجرت ” شناخته شده است. دلیل این مهاجرت ساختار ماتریکس نفوذپذیر ژل است که مولکول‌ها را قادر میسازد از میان منافذ موجود در آن عبور و در طول ژل حرکت کنند.
- خلاصه ای از تکنیک الکتروفورز
اساس کار این تکنیک اعمال جریان الکتریکی است که منجر به جداسازی و شناسایی مولکول ها میشود . همان گونه که در بالا شرح دادیم کاربرد این روش در آزمایشگاه های مولکولی و بیوشیمی برای جداسازی مولکولهای باردار مانند RNA ،DNA و پروتئین است. ژلی که برای این تکنیک استفاده میشود از پودر آگاروز ( آگارز) و یا پلی آکریلامید است . ساختار این ژل ها منفذ دار است و همین امر موجب میشود ، مولکول‌ها با اندازه‌های متفاوت به راحتی از آن عبور کند. برای کوچک یا بزرگ کردن این منافذ جهت حرکت مولکول های کوچکتر و یا بزرگتر ، میتوانیم غلظت ژل های مورد استفاده درالکتروفورز را کمتر و یا بیشتر کنیم.
- کاربردهای تکنیک ژل الکتروفورز
کاربرد اصلی این متد در آزمایشگاه ها به دو بخش اصلی تقسیم میشود :
- جداسازی مولکولهای DNA که یا بصورت استخراج شده هستند و یا محصول PCR ، ریل تایم و یا کلونیگ ژن
- بررسی و مطالعه کیفیت محصول PCR
منافذ بزرگ ژل آگاروز قطری حدود ۱۰۰ تا ۵۰۰ نانومتردارد که کاملا متناسب برای جداسازی مولکولهای DNA با طول بالا میباشد. البته این تکنیک برای جداسازی پروتئین‌ها نیز میتواند بسیار ایده آل باشد ، اما روش رایج شناسایی پروتئین‌ها ، کروماتوگرافی است. اما توجه داشته باشید که تکنیک ژل الکتروفورز نیز بعنوان یک متد ساده و اقتصادی میتواند برای شناسایی پروتئین ها کاربرد داشته باشد. در اصطلاح آزمایشگاهی روش الکتروفورز ژل پلی آکریلامید که منافذی با قطر 10 تا 200 نانومتر دارد برای جداسازی پروتئین‌ها بسیار ایده آل است.به این روش PAGE نیز گفته میشود مبنای آن بر اساس سایز پروتئین ها است.
- انواع الکتروفورز
عملکرد الکتروفورز به دو روش عمودی یا افقی میباشد که هر یک کاربردهای مخصوص به خود را دارد.
از تفاوت های آشکار این دو جهت قرارگیری ژل است :
در الکتروفورز افقی، ژل مورد استفاده آگاروز است و نیز قرارگیری ژل به صورت افقی در محیط بافر است،
الکتروفورز عمودی ، ژل مورد استفاده پلی آکریلامید است و قرارگیری ژل به صورت عمودی و درون محفظه الکتروفورز است و تماس آن با بافر محدود است.
(توجه داشته باشید که در روش عمودی ، نمیتوان از ژل آگاروز استفاده کرد و فقط از ژل پلی آکریلامید استفاده میشود چون در پلیمریزه شدن آن ، اکسیژن بعنوان یک مهارکننده فعالیت دارد. در الکتروفورز افقی ژل در ارتباط مستقیم با اکسیژن است. بنابراین از الکتروفورز عمودی که تماس آن با اکسیژن محدود است استفاده میکنند.
در اینجا به تفاوتهای اصلی دو ژل پلی آکریلامید و ژل آگاروز میپردازیم:
- از پلی ساکارید جلبک های دریای تهیه میشود.
- درون کاست افقی شکل میگیرد.
- برای استفاده، ایمن است.
- قادر به جداسازی مولکول های بزرگ است.
- ایده آل برای جداسازی DNA است.
- دارای منافذ بزرگ است.
- ساختار ساده ای دارد.
ژل پلی آکریلامید (PolyAcrylamid):
- از اتصالات عرضی پلیمر آکریلامید درست میشود.
- درون کاست عمودی شکل میگیرد.
- سمی و خطرناک است.
- قادر به جداسازی مولکول های کوچک نیز است.
- برای جداسازی پروتئین و DNA کاربرد دارد.
- دارای منافذ کوچک است.
- ساختار سخت و پیچیده ای دارد.
- تهیه ژل برای انجام الکتروفورز
همانطور که گفته شد با توجه به تکنیک مورد نظر از از آگاروز و یا پلی آکریلامید استفاده میشود. این مواد بصورت پودر در اختیار کاربر قرار میگیرد و پس از مخلوط با بافرهای مخصوص و حرارت دادن به یک مایع شفاف تبدیل میشود. بر اساس غلظت مورد نظر ، مقدار مشخصی از پودر را در بافر TAE و یا TBE مخلوط و حل میکنند. سپس مایع شفاف به دست آمده را درون کاست ژل و در محفظه ای بنام تانک الکتروفورز ریخته و توسط شانه چاهک ،چاهک‌هایی برای قراردادن نمونه آماده میشود . مایع بعد از خنک شدن، بصورت ژل بسته شده و خنک میشود.
خاصیت بافر درون تانک الکتروفورز ، آسان کردن عبور جریان از ژل است . این تانک با دو الکترود به یک منبع الکتریکی برای ایجاد جریان الکتریکی متصل میشود.
برای مشاهده نمونه‌ها روی ژل، هنگام قرار دادن آنها درون چاهک،از رنگهای قابل مشاهده با نور UV مانند DNA safe stain استفاده میشود.البته در گذشته، از اتیدیوم بروماید برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌شد، اما به دلیل سمی و جهش‌زا بودن آن ها، کار با آنها در آزمایشگاه ها ممنوع اعلام شد. پس از پایان حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی قطع میشود و ژل توسط دستگاهی به نام ژل داک تصویربرداری میشود.
- طرز تهیه ژل آگاروز
غلظتی که برای ژل آگاروز در نظر گرفته میشود معمولا بین 0.7 تا 2 درصد میباشد که بر اساس اندازه مولکول های مورد نظر ساخته میشود. درصورتیکه هدف از الکتروفورز فقط جداسازی و شناسایی کیفی مولکول‌ها باشد ، پیشنهاد برتر برای تهیه ژل، آگاروز است.
برای ساخت ژل با غلظت 2%، دو گرم از پودر آگاروز را در ۱۰۰ میلی‌لیتر از بافر TAE یا TBE حل می‌کنیم. توجه کنید که تانک الکتروفورز را با همان بافری که برای تهیه ژل استفاده میکنید ، پر کنید. این مخلوط با حرارت دادن تبدیل به مایع شفاف و یکنواختی میشود. حرارت باعث حل شدن تمام ذرات آگاروز در بافر میشود. همانطور که قبلا اشاره کردیم ، ژل آگاروز بیشتر در الکتروفورز افقی استفاده میشود.
- مواد لازم برای تهیه بافرها
استفاده از هر یک از این بافر ها با توجه به نوع مولکول و هدف از جداسازی انتخاب میشود.
- بافر TAE یا Tris/Acetate/EDTA: برای تهیه این بافر از تریس (Tris-base)، استات (Acetate) و EDTA به همراه آب استفاده میشود.
- بافر TBE یا Tris/Borate/EDTA: برای تهیه این بافر تریس به همراه بوریک اسید (Boric acid) در آب رقیق شده و با Na2EDTA مخلوط میشود.
خصوصیات بافر TAE:
- برای جداسازی قطعات بلند DNA
خصوصیات بافر TBE:
- برای شناسایی قطعات DNA با طول 2kb
- ایجاد محیطی با رسانایی بالا
- مناسب جهت الکتروفورزهای طولانی
- تشکیل باندهای بهتر نسبت به بافر TAE
- طرز تهیه ژل پلی آکریلامید:
برای تهیه این ژل ترکیب دو ماده پلی آکریلامید و بیس آکریلامید به همراه حجم مشخصی از آب استفاده میشود .سپس محلول را برای تخلیص از فیلتر عبور داده و در دمای اتاق در فضای تاریک نگهداری میشود. بافر مورد استفاده در این ژل معمولا بافر TBE است. قبل از ریختن محلول در کاست به آن آمونیوم پرسولفات و TEMED اضافه میکنند تا پلیمریزاسیون ژل سریع تر انجام شود.توجه کنید که کار با TEMED باید در شرایط خاص ایمنی و زیر هود آزمایشگاهی انجام شود چون بسیار خطرناک و جهش زا است. از ژل پلی‌آکریلامید در الکتروفورز عمودی و جهت جداسازی پروتئین و مولکولهای DNA کوچک و تک رشته‌ای استفاده میشود.
- الکتروفورز مولکولهای DNA
با این تکنیک کاربر قادر به شناسایی مولکولهای DNA با طول های متفاوت است. از آنجاییکه مولکولهای DNA دارای بار منفی هستند زمانی که روی ژل و تحت جریان الکتریی قرار میگیرند به سمت الکترود مثبت حرکت میکنند. در این شرایط ، جداسازی مولوکول های DNA ، تنها بر اساس اندازه و سایز آنها انجام میشود. حرکت رشته‌های کوتاه DNA سرعت بیشتری نسبت به مولکولهای بلندتر دارند، بنابراین جداسازی مولکولهای DNA با اندازه‌های متفاوت آسان تر انجام میشود.همانطور که قبلا هم اشاره کردیم ردیابی نمونه ها، با اضافه کردن رنگهای فلورسنت درون چاهک ژل انجام میگیرد. بعضی از کاربران، رنگهای فلورسنت را با ژل ، درست قبل از انتقال آن به قالب الکتروفورز مخلوط میکنند که در این شرایط ، نیاز به اضافه کردن رنگ هنگام لود نمونه نیست. الکتروفورز برای مولکولهای DNA به صورت افقی انجام میگیرد که روشی ساده‌تر نسبت به روش عمودی است.
بعد از توقف جریان، باند مولکولهای DNA در اندازه‌های مختلف بر روی ژل نمایان است که جهت تعیین اندازه باند نمونه، از یک نشانگر و یا در اصطلاح (Ladder) به عنوان استاندارد استفاده میشود. Ladder ( لدر ) روی ژل به صورت باندهایی با طول معین نمایان بوده و با استفاده از آن اندازه باندهای نمونه بر روی ژل را می توان ارزیابی کرد.
- الکتروفورز پروتئین‌ها با استفاده از الکتروفورز به روش PAGE
دو عامل مهم بار الکتریکی و اندازه مولکول ها در الکتروفورز پروتئین ها نقش مهمی دارند.اما میتوان با روش خاصی این جداسازی را تنها بر مبنای اندازه پروتئین ها انجام داد که برای این هدف باید بار مولکولهای پروتئین را یکسان کرد . در تکنیک PAGE ، با حرارت دادن و اتصال دترجنت آنیونی به پروتئین‌ها، میتوان بار مولکولهای پروتئینی منفی کرد. دترجنت آنیونی (SDS) به نواحی آبگریز پروتئین‌ها وصل و منجر به دناتوره شدن آنها میشود . در واقع SDS بار الکتریکی مولکولهای پروتئین را می‌پوشاند. سپس با استفاده از شرایطی که ژل پلی‌آکریلامید ایجاد میکند، پروتئین‌ها در طول ژل بر مبنای سایز، از هم جدا می‌شوند.
توجه داشته باشید که معمولا” در آزمایشگاه ها جهت مطالعه کیفی نمونه‌ها ، از الکتروفورز افقی با ژل آگاروز استفاده میشود. چون این روش ارزان‌تر، ساده‌تر و سریع‌تر از روش‌های دیگر قابل انجام است. اما جهت مطالعه کمی و نتایج دقیق تر و حساس تر ،روش الکتروفورز عمودی گزینه بهتری است.