مقدمه ای از رنگ آمیزی اختصاصی اویل رد در بافت‌شناسی
رنگ آمیزی اویل رد O (Oil red O) یا روغن قرمز O از قدیمی ترین و متداول ترین تکنیک های کاربردی در تشخیص چربی در نمونه های بافتی است. رنگ اویل رد یا Oil red که یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی بافت میباشد، یک رنگ لیزوکروم محلول در چربی است که جهت اندازه گیری کمی و کیفی تری‌گلیسریدها، لیپوپروتئینها و لیپیدهای موجود در نمونه های بافتی تازه و فروزن حاوی چربی در پاتولوژی کاربرد دارد. این رنگ هیدروفیلیک قابلیت شناسایی و تشخیص انواع چربی ها را دارد. رنگ محلول در چربی ORO یا اویل رد O با فرمول شیمیایی C26H24N4O و جرم مولکولی ۴۰۸.۵۱۰ شامل دو گروه azo، چهار گروه متیل و یک گروه هیدروکسیل می باشد. رنگ های azo دارای ساختارهایی هستند که مانع از یونیزاسیون آنها شده و در نتیجه حلالیتشان را در لیپیدها آسان می کند. ORO یا اویل رد O اشعه با طول موج ۵۱۸ نانومتر جذب کرده و نمونه هدف را قرمز می کند.
ساختار اویل رد O با فرمول شیمیایی C26H24N4O
انواع کاربردهای رنگ آمیزی اختصاصی اویل رد در بافت شناسی
رنگ آمیزی اویل رد از روش های پرکاربرد در آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی می باشد. از جمله کاربرد های آن می توان به موارد زیر اشاره نمود.
- رنگ آمیزی اویل رد در پاتولوژی:
در حوزه پاتولوژی، این رنگ آمیزی جهت تشخیص تعدادی از بیماریها از جمله بیماریهای متابولیکی کاربرد دارد. تشخیص بیماریهای آمبولی چربی در ریه ها، کبد چرب، شناسایی و تشخیص لیپیدها در توبول‌های پروکسیمال کلیه ها به عنوان مارکر تشخیصی دیابت و کتواسیدوز دیابتی با این روش رنگ آمیزی اویل رد انجام می شود. - رنگ آمیزی اویل رد در پزشکی قانونی:
از تکنیک رنگ‌آمیزی روغن قرمز O در صحنه جرم جهت تشخیص اثر انگشت مجرم روی محیط خشک و مرطوب نیز استفاده می شود. اثر انگشت و عرق فرد مجرم شامل گلیسرید، اسیدهای چرب، استرهای موم و غیره می باشد. - رنگ آمیزی اویل رد در تحقیقات کشت سلولی و پاتوفیزیولوژی سلولی:
تشخیص و مشاهده میزان تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی در کشت سلولی توسط رنگ آمیزی اویل رد انجام می شود.
نگاهی اجمالی به بافت و سلولهای چربی رنگ شده با اویل رد
بافت چربی یک بافت همبند سست است که عمدتا از آدیپوسیت ها یا سلول های چربی تشکیل شده است. علاوه بر این سلولها، بافت چربی نیز حاوی بخش عروقی استرومایی (stromal vascular fraction) سلول‌هایی است که از جمله آنها می توان به پیش‌آدیپوسیت‌ها، فیبروبلاست‌ها، سلولهای اندوتلیال عروقی و انواع سلولهای ایمنی مانند ماکروفاژها اشاره نمود. نقش اصلی بافت چربی ذخیره انرژی بدن به شکل لیپید می باشد. ذخیره و آزادسازی لیپید از سلولهای چربی در بافت چربی فاکتورهای اصلی در تنظیم تعادل انرژی هستند. یک منبع مهم برای تجدید سلول های چربی در تمام طول عمر، مغز استخوان است.
بافت چربی نیز به عنوان یک غده درون ریز اصلی شناخته شده است زیرا هورمون هایی مانند لپتین، استروژن و سیتوکین ها را تولید می کند. دو نوع بافت چربی عبارتند از: بافت چربی سفید که انرژی را ذخیره می کند و بافت چربی قهوه ای که گرمای بدن را تولید می کند. به نظر می رسد تشکیل بافت چربی تا حدودی توسط ژن چربی کنترل می شود. فرآیندهای التهابی مزمن از عوامل کلیدی در اختلال عملکرد بافت چربی هستند که منجر به بیماریهای مختلف مرتبط با بافت چربی از جمله بیماری های متابولیکی می شود.
انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی اویل رد
رنگ آمیزی اویل رد در بافت شناسی روی نمونه های بافتی حاوی سلولهای چربی از جمله بافت چربی، چربی قهوه ای، بافت چربی سفید، بافت کبد سالم و چرب تازه منجمد شده در دمای منفی هشتاد، انجام می شود. رنگ آمیزی اویل رد در بافت شناسی روی نمونه های بافتی تازه منجمد شده در دمای منفی هشتاد انجام می شود. در این تکنیک نمی توان از برشهای پارافینی بافت ها استفاده نمود چرا که چربی و لیپیدها از این بافت ها به مرور حذف می شود. البته در بعضی موارد نادر جهت تشخیص لیپوپروتئینها در نمونه های پارافینی نیز استفاده می شود. همچنین می توان روی نمونه های سیتولوژی خشک شده در محیط و سلولهای چربی تمایز یافته کشت داده شده در محیط آزمایشگاهی (In vitro) این تست را انجام داد.
پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی اویل رد در بافت‌شناسی
- در تکنیک رنگ‌آمیزی روغن قرمز O ابتدا محلول اویل رد O را با حل کردن پودر اویل رد در ایزوپروپانول ۹۹% بصورت تازه آماده می کنیم. روش دیگر این است که پودر اویل رد O را در پروپیلن گلیکول حل گردد.
- در دستگاه فروزن سکشن، نمونه روی پایه محتوی چسب اختصاصی برش فروزن برای قالبگیری قرار می‌دهیم. پس از بسته شدن نمونه در دستگاه فروزن سکشن، برش های بافتی فروزن با اندازه ۸ الی ۱۰ میلی‌متر تهیه می کنیم. برش های تهیه شده را روی لام قرار داده تا با جریان هوا خشک شوند.
- برشها را در فرمالین فیکس می‌کنیم.
- سپس برشها را با آب به مدت ۱ الی ۱۰ دقیقه شستشو می دهیم.
- برشهای فیکس شده را در ایزوپروپانول ۶۰% شناور می کنیم.
- اسلاید های میکروسکوپی حاوی برشهای فیکس شده را به مدت ۱۵ دقیقه با محلول اویل رد O تهیه شده رنگ‌آمیزی می کنیم.
- در این مرحله نیز هسته سلولهای نمونه ها را نیز با هماتوکسیلین الوم رنگ کنیم. اسلایدها را به مدت یک الی ۲ دقیقه در جار رنگ آمیزی حاوی رنگ هماتوکسیلین قرار می دهیم.
- اسلایدها را با آب مقطر شستشو می‌دهیم.
- نهایتا نمونه‌ها را با چسب انتلان و لامل مونت کرده و زیر میکروسکوپ نوری بررسی می کنیم.
تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ آمیزی اویل رد
مواد مورد نیاز
- محلول اویل رد O
- ایزوپروپانول و پروپیلن گلیکول
- رنگ افتراقی هماتوکسیلین
- چسب انتلان
تجهیزات مورد نیاز
• دستگاه فروزن سکشن
• چسب اختصاصی برش فروزن برای قالبگیری
• جار رنگ‌آمیزی لام
• میکروسکوپ نوری یا فلورسنت
• لام و لامل
تفسیر نتایج رنگ آمیزی اویل رد
همانطور که توضیح داده شد رنگ اویل رد O سلولهای چربی موجود در نمونه بافتی فروزن یا سلولهای آدیپوسیت کشت داده شده در محیط آزمایشگاهی را قرمز رنگ آمیزی می‌کند. بررسی کیفی و کمی سلولهای چربی در بافت های سالم و بیمار مانند تومور لیپوسارکوما با رنگ آمیزی اویل رد قابل انجام می باشد. سلولهای چربی به رنگ قرمز زیر میکروسکوپ نوری مشاهده می شود و چنانچه از رنگ آمیزی‌های دیگر برای هسته سلولها نیز استفاده شود هسته ها نیز قابل مشاهده می شوند. به عنوان مثال رنگ آمیزی هماتوکسیلین الوم، هسته ها را به رنگ آبی رنگ آمیزی می کند.
در شکل شماره ۳ (شکل زیر) رنگ آمیزی اویل رد امکان مشاهده رسوب چربی در بافت کبد نرمال و چرب موش آزمایشگاهی را نشان می دهد. نمونه گروه کنترل (شکل سمت چپ) هیچ چربی در بافت کبد ندارد در نتیجه رنگ قرمز اویل رد مشاهده نمی شود. اما در نمونه مبتلا به کبد چرب (شکل سمت راست) تجمع چربی با رنگ قرمز قابل مشاهده می باشد.
جمع بندی
یکی از رنگ آمیزی های اختصاصی در آزمایشگاه پاتولوژی تشخیصی و تحقیقاتی، رنگ آمیزی اختصاصی سلولهای چربی با نام اویل رد O است. رنگ آمیزی لیپیدها با رنگ های محلول در روغن بر اساس میزان حلالیت بیشتر رنگ در مواد لیپوئیدی نسبت به حلال های هیدروالکلی می باشد. تجمعات سلولهای چربی و لیپیدها در بافتی های محیطی می تواند منجر به برخی بیماریهای متابولیکی گردد که یکی از راه های تشخیص این توده های چربی در بیماران مشکوک انجام رنگ آمیزی های پاتولوژی از جمله اویل رد O است. در این مقاله تلاش شد تا آموزشی جامع از رنگ‌آمیزی اویل رد و نتایج حاصل از آن را توضیح دهیم.