16. دوره طراحی پرایمر و اصول PCR

Description

اصول طراحی پرایمر

•  طول پرایمر(Primer) : بطور میانگین باید بین 18-25 جفت باز باشد. البته در بعضی از شرایط این اندازه کمتر و بیشتر هم می شود.
• درصد GC: پرایمرهای فوروارد و ریورس نزدیک هم باشد که در حالت ایده آل حدود 45-55 درصد می باشد.
• آزاد بودن سر 3 پریم: پرایمرهای فوروارد و ریورس نباید در سر 3 پریم، دارای بازهای G و C باشند.
• مکمل نباشند: پرایمرهای فوروارد و ریورس نباید مکمل همدیگر باشند. زیرا باعث تولید پرایمر دایمر می شود.
• توالی تکراری سر 3 پریم: پرایمرهای فوروارد و ریورس باید دارای توالی تکراری غیر مکمل یکدیگر داشته باشند.
•  دمای TM پرایمرها: دمای TM (Melting Temperature) پرایمرها باید نزدیک به یکدیگر باشند. اختلاف TM دو پرایمر باید کمتر از 2 و در حالت ایده آل صفر باشد.
• دمای TA پرایمرها: دمای TA (Annealing Temperature) پرایمرها باید نزدیک به یکدیگر باشند.
• طول محصول PCR: طول محصول PCR برای مطالعات مختلف متفاوت است. معمولا حدود 70 تا800 جفت باز طول دارند که بهترین محصول را برای مطالعات مختلف می شود در این بازه مشاهده کرد. مثلا برای Real time PCR طول محصول بین 70 تا 120 جفت باز بهترین حالت است.

Gene Data Base

به دلیل افزایش سریع در داده های زیستی در زمینه های مختلف مانند: مقالات، ثبت اختراعات، گزارش ها، توالی های نوکلئوتیدی یا اسید آمینه ای، ساختار سه بعدی، بررسی های ژل الکتروفورز و … ایجاد پایگاه های زیستی ضرورت یافته است.

سه پایگاه معتبر برای حفظ و ذخیره اطلاعات نوکلئوتیدی وجود دارد:

1. GenBank در آمریکای شمالی
2. EMBL در اروپا
3. DDBJ در آسیا

یکی از اولین پایگاه ها GenBank می باشد، که در سال 1982 میلادی با تنها 5 توالی شروع شد. اما امروزه بیش از 100 میلیون اطلاعات در آن به ثبت رسیده است.

برای طراحی پرایمر در قدم اول باید توالی اسید نوکلئیک را از دیتا بانک استخراج و طراحی پرایمر را بر روی آن انجام داد.

برای اینکه راحت تر کار را لمس کنید مثالی را برای بررسی بیان ترانسکریپت ژن BCL2 برای روش RT-PCR با هم انجام می دهیم.

برای این کار وارد سایت https://www.ncbi.nlm.nih.gov  می شویم و ژن مورد نظر را پیدا را جستجو و گزینه Gene را انتخاب می کنیم.