03. دوره کارآموزی ارشد آزمایشگر

Description

دوره کارآموزی ارشد آزمایشگر

آموزشگاه آزاد تکوین ژن (فن آوری اوژن) اولین آموزشگاه رسمی فنی و حرفه ای در رشته زیست فناوری در تهران، مفتخر است با در اختیار داشتن امکانات و تجهیزات آزمایشگاهی و فضای مناسب آموزشی و اساتید مجرب و باتجربه در زمینه آموزش کارآموزان و دانشجویان محترم دوره کارآموزی ارشد آزمایشگر را برگزار کند.

ویژگی های این دوره:

• تدریس عملی و تئوری مباحث
• انجام تکنیک توسط خود کارآموز
• ارائه مدرک بین المللی قابل ترجمه
• برگزاری کلاس ها به صورت نیمه خصوصی(۴ تا ۵ نفره)
• زمانبدی کلاسها با توجه به وقت و زمان کارآموز

ژنتیک مولکولی (به انگلیسی: Molecular genetics) شاخه‌ای از زیست‌شناسی و ژنتیک است که به بررسی ساختار و کارکرد ژن‌ها در سطح مولکولی می‌پردازد. ژنتیک ملکولی با بکار گرفتن روش‌های ژنتیکی و زیست‌شناسی ملکولی سعی دارد تا عملکرد و فعل و انفعالات بین ژنها را شناسایی کند. این شاخهٔ زیست‌شناسی، علاوه بر بررسی چگونگی جابجایی ژن‌ها از نسلی به نسل دیگر، به فهم بهتر زیست‌شناسی رشد و جهش ژنتیکی که می‌توانند منجر به انواع خاصی از بیماریها شوند کمک می‌کند. از طریق بکارگرفتن روش‌های ژنتیکی و زیست‌شناسی ملکولی، ژنتیک ملکولی سعی دارد به علل مربوط به حمل و انتقال خصوصیتهای خاص بین گونه‌های مختلف جانداران و همچنین دلایل و نحوهٔ جهشهای ژنتیکی پی ببرد.

ژنتیک مولکولی حوزه‌ای از زیست‌شناسی است که ساختار و عملکرد ژن‌ها را در سطح مولکولی مطالعه می‌کند؛ بنابراین هم از روش‌های زیست مولکولی و هم از ژنتیک استفاده می‌کند. مطالعه کروموزوم‌ها و بیان ژن از یک ارگانیسم می‌تواند درک و فهمی از وراثت، تنوع ژنتیکی و جهش‌ها را ایجاد کند که این در مطالعه زیست‌شناسی تکاملی  developmental biology و در فهم و درمان بیماری‌های ژنتیکی مفید است.

تکنیک‌ها:

• بافر سازی و محلول سازی

محلول ‌سازی (به انگلیسی:  Solubilization ) شامل انحلال ماده‌ی حل‌شونده (جامد، مایع، گاز) در یک حلال است. حلال می‌تواند آب یا هر مایع دیگری باشد که قابلیت حل‌کردن حل‌شونده را داشته باشد. برای انجام آزمایش‌های علمی لازم است مقدار دقیق حل‌شونده در حلال معلوم باشد. تیترسنجی، واکنش‌های خنثی‌سازی و واکنش‌های اکسیداسیون و احیا از جمله مواردی هستند که با محلول ‌سازی سروکار دارند. محلول سازی یکی از ابتدایی ترین کارها در آزمایشگاه و از مهمترین مباحث و مقدمات آزمایشگاه است که شما در انجام تست های مختلف، کار با کیت ها و دستگاه های آزمایشگاهی و غیره با آن سر و کار دارید.

دو اصطلاح کلیدی در مورد بافر وجود دارد.بافر محلولی آبی است که دارای pH بسیار پایدار است. عامل بافری اسیدی ضعیف و یا بازی ضعیف است که به ثابت ماندن pH یک محلول آبی پس از افزوده شدن اسید و یا باز به آن کمک می کند. هر محلول بافری دارای یک محدوده عملکردی pH است و می تواند در مقابل مقدار تغییر pH به ازای مقدار مشخصی اضافه شدن باز یا اسید مقاومت کند که به آن ظرفیت بافری گفته می شود.

• PCR

تکثیر ژن روشی است که در آن یک ژن خاص یا یک توالی از DNA در فرآیندی که همانندسازی DNA نامیده می‌شود به دفعات زیاد تکثیر می‌شود. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز اجزای اصلی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) نوکلئوتیدهای DNA, DNAی الگو، پرایمر و تگ پلیمراز هستند. نوکلئوتیدهای DNA از روی رشته الگو توالی خاصی را می‌سازند. پرایمرها رشته‌های کوتاهی از نوکلئوتیدهای مکمل هستند که همانندسازی از آنجا آغاز می‌شود، تگ پلیمراز نیز یک آنزیم مقاوم به حرارت است که نوکلئوتیدها را در مقابل رشته الگو قرار داده و رشته‌هایی جدید تکثیر می‌یابند.

برای شکل‌گیری یک واکنش PCR و تکثیر ژن مورد نظر نیاز به مواد و اجزای متنوعی داریم تا تکثیر ژن به درستی انجام گرفته و مراحل انجام دادن آن بدون نقص و کامل باشد. علاوه بر رشته اصلی DNA نیاز به مواد دیگری از جمله آنزیم داریم تا قطعات کوچک نوکلئیک اسید در کنار هم چیده شده و قطعات جدید را از روی رشته الگو بسازند.

به طور معمول، هدف از انجام PCR تولید کافی از ناحیه DNA هدف است که بتوان آن را تجزیه و تحلیل یا به روش دیگری استفاده کرد. این منطقه DNA می‌تواند هر چیزی باشد که پژوهش‌گر به آن علاقه دارد. به عنوان مثال، ممکن است ژنی باشد که محقق می‌خواهد عملکرد آن را بفهمد یا یک مارکر ژنتیکی است که توسط دانشمندان پزشکی قانونی برای مطابقت DNA صحنه جرم با مظنونان استفاده می‌شود.

• انواع PCR

پی سی آر نامتقارن (Asymmetric PCR)

پی سی آر کلونی (Colony PCR)

پی سی آر دژنره (Degenerate PCR)

پی سی آر هات استارت (Hotstart PCR)

پی سی آر معکوس  (Inverse PCR)

پی سی آر مینی پرایمر (Miniprimer PCR)

پی سی آر چندگانه (Multiplex PCR)

پی سی آر آشیانه (Nested)

پی سی آر تاچ داون (Touchdown)

• استخراج DNA

طی ایزولاسیون (استخراج) DNA,DNA به شکل خالص از یک سلول استخراج می‌شود. در مرحله اول DNA از اجزای سلولی مانند پروتئین‌ها، RNA و لیپیدها جداسازی می‌شود. این عمل بوسیله قرار دادن سلول‌ها در یک لوله باریک حاوی محلولی که به شکل مکانیکی و شیمیایی سلول‌ها را می‌شکند انجام می‌شود. محلول، حاوی آنزیم‌ها، مواد شیمیایی و نمک‌هایی است که سلول‌ها را می‌شکنند اما به DNA آسیبی نمی‌رسانند. آنزیم‌های این محلول، باعث حل شدن پروتئین‌ها شده و مواد شیمیایی موجود در آن باعث تخریب تمام RNAهای موجود می‌شود. نمک‌ها نیز به بیرون کشیدن DNA به داخل محلول کمک می‌کنند. در مرحله بعد DNA از محلول بوسیله چرخش در یک سانتریفیوژ (که می‌تواند DNA را در انتهای یک لوله جمع‌آوری کند) جداسازی می‌شود. پس از سانتریفیوژ محلول رویی دور ریخته شده و DNA مجدداً در یک محلول ثانویه ریخته می‌شود که این فرایند کار با DNA را در مراحل بعدی تسهیل می‌سازد. نتیجه حاصل از این فرایند، DNA تغلیظ شده‌ای است که حاوی هزاران نسخه از ژن است. در پروژه‌هایی در مقیاس بزرگ مانند پروژه توالی یابی ژنوم انسان تمام این کارها بوسیله روبات انجام می‌شود.

• انواع استخراج DNA

استخراج DNA به دو روش کلی وجود دارد:
۱ -روش دستی:
فنول کلروفرم
salting out
۲ -کیت های تجاری :
کیت رسوبی
کیت ستونی

• استخراج RNA

DNA بیان شده که سنتز یک پروتئین را کد می‌کند هدف نهایی دانشمندان است که بوسیله استخراج mRNA (RNA پیام بر) بدست می‌آید. در ابتدا از یک فرایند طبیعی سلولی که در آن حدود ۲۰۰ نوکلئوتید آدنین به RNA پیام بر اضافه می‌شود و دم پلی آدنین نام دارد استفاده می‌شود. در مرحله بعد سلول گسیخته می‌شود و محتوای سلول در معرض دانه‌های مصنوعی پوشیده از رشته‌های تیمین قرار می‌گیرند. از آنجاییکه آدنین و تیمین در رشته DNA با یکدیگر جفت می‌شوند دم پلی (A) و دانه‌های مصنوعی به یکدیگر متصل شده و پس از آن محتوای سلولی شسته می‌شوند اما رشته‌های mRNA همچنان متصل باقی می‌مانند. زمانی که mRNA ایزوله می‌شود، از ترانس کریپتاز معکوس به منظور تبدیل آن به یک DNA تک رشته استفاده می‌گردد. در مرحله بعد این DNA تک رشته‌ای توسط DNA پلیمراز به DNA دورشته‌ای تبدیل می‌شود. DNA مکمل (cDNA) بسیار پایدارتر از mRNA است بنابراین DNA تولید شده توالی DNA هدف محققان را به نمایش می‌گذارد.

• توالی یابی DNA

توالی یابی DNA به دو روش اصلی در سراسر جهان انجام میگیرد. روش قدیمی آن به عنوان روش خاتمه زنجیره ای یا روش سنگر  شناخته می شود. روشهای جدیدتر که میتوانند تعداد زیادی از مولکولهای DNA را به سرعت پردازش کنند، در مجموع به عنوان روشتوالی یابی با بازدهی بالا (Sequencing Throughput High) یا روشهای توالی یابی نسل جدید (Sequencing Generation Next) یا (NGS) معروف هستند .

• توالی یابی سنگر یا Sanger Sequencing

ﺗﻮاﻟﯽ ﯾﺎﺑﯽ DNA Sequencing) DNA) ﻓﺮآﯾﻨﺪي اﺳﺖ ﮐﻪ ﺑﻪ ﺗﻌﯿﯿﻦ ﻧﻮﮐﻠﺌﻮﺗﯿﺪ ﻫﺎي ﻗﺴﻤﺘﯽ از DNA ﻣﯿﭙﺰدازد. اوﻟﯿﻦ ﻧﺴﻞ از ﺗﻮاﻟﯽ ﯾﺎﺑﯽ در ﺳﺎل 1977 ﺗﻮﺳﻂ ﻓﺮدرﯾﮏ ﺳﻨﮕﺮ(Frederick Sanger) اﺑﺪاع ﺷﺪ و ﺑﻪ ﭘﺎس زﺣﻤﺎت اﯾﺸﻮن ، اﯾﻦ ﺗﮑﻨﯿﮏ را ﺗﻮاﻟﯽ ﯾﺎﺑﯽ ﺳﻨﮕﺮ (Sanger Sequencing) ﻧﺎﻣﯿﺪﻧﺪ. در ﺗﮑﻨﯿﮏ سنگر از روش ﺧﺘﻢ زﻧﺠﯿﺮه اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪه اﺳﺖ ﮐﻪ ﭘﺎﯾﻪ و اﺳﺎس ﺑﻌﻀﯽ از ﺗﮑﻨﯿﮏ ﻫﺎي ﺳﮑﻮﺋﻨﺴﯿﻨﮓ ﻧﺴﻞ ﺑﻌﺪي ﻣﯿﺒﺎﺷﺪ. در ﺳﺎل 1980 ﺟﺎﯾﺰه ﻧﻮﺑﻞ ﺷﯿﻤﯽ ﺑﻪ ﻓﺮدرﯾﮏ ﺳﻨﮕﺮ ﺑﺎﺑﺖ اﺑﺪاع اﯾﻦ روش اﻫﺪا ﺷﺪ. از ﺗﮑﻨﯿﮏ ﺳﻨﮕﺮ ﺑﺮاي ﺗﻮاﻟﯽ ﯾﺎﺑﯽ در ﭘﺮوژه ژﻧﻮم اﻧﺴﺎن اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ.

روش سنگر (Sanger) به یک آغازگر متکی است که به مولکول DNA دناتوره شده (تک رشته ای) متصل میشود و سنتز یک مولکول پلی نوکلئوتیدی تک رشتهای را در حضور یک آنزیم DNA پلیمراز، با استفاده از DNA دناتوره شده به عنوان رشته الگو آغاز میکند. در بیشتر شرایط، آنزیم با اضافه کردن نوکلئوتیدها به رشته آغازگر، واکنش را کاتالیز می کند. بنابراین پیوند کووالانسی بین اتم کربن ‘3 مولکول قند دئوکسی ریبوز در یک نوکلئوتید و اتم کربن ‘ 5 نوکلئوتید بعدی تشکیل میشود.

• ژل الکتروفورز

از روش های آزمایشگاهی مرسوم جهت جدا کردن مولکولهای باردار تکنیک ژل الکتروفورز میباشد .این جداسازی با توجه به اندازه، بار و جرم مولکولی آنها انجام میگیرد.فرایند کلی این تکنیک به این صورت است که با برقراری جریان در ژل الکتروفورز ، دو سمت ژل دارای دو قطب مخالف مثبت و منفی میشود که باعث میشود مولکول های باردار به سمت قطب مخالف خود حرکت کنند. این عمل حرکت مولکول ها تحت اصطالح “ مهاجرت “ شناخته شده است. دلیل این مهاجرت ساختار ماتریکس نفوذپذیر ژل است که مولکولها را قادر میسازد از میان منافذ موجود در آن عبور و درطول ژل حرکت کنند.

• طراحی پرایمر

پرایمر، یک مولکول کوچک تک-رشتهای از جنس DNA است که در واکنش PCR شرکت میکند و سر ′3هیدروکسیل آزاد را در اختیار آنزیم Taq پلیمراز قرار میدهد. میدانیم که در ژنوم موجودات پیچیده ای مانند انسان، در هر ناحیه، تنها یکی از دو رشته DNA به عنوان ژن فعال، عمل میکند. معموال هدف از انجام PCR ،تکثیر این ناحیه است و به آن »ناحیه هدف (Region Target ) می گوییم. برای این کار به دو پرایمر نیاز است که یکی به رشته هدف و دیگری به رشته مکمل آن متصل میشود.

• GeneRunner primer express

نرم افزار gene runner یک نرم افزار بسیار حرفه ‌ای، کامل و جامع و درعین حال ساده برای بررسی و آنالیز ژن‌ها و  طراحی پرایمر و چک کردن پرایمرهای طراحی شده است. این نرم افزار به پژوهشگران کمک می کند تا توالی DNA و RNA خود را به راحتی تجزیه و تحلیل کنند. از نرم افزار gene runner می توان به صورت آفلاین استفاده کرد و نیازی به اتصال به اینترنت ندارد.