02. دوره جامع کارآموزی مولکولی

Description

دوره جامع کارآموزی مولکولی

ژنتیک مولکولی (Molecular Genetics) بررسی و به کارگیری دانش مولکولی در زمینه وراثت و ژنوم ارگانیسم‌ها است. در این مبحث از بیولوژی سازوکارهای مختلف در ارتباط با انواع اسیدهای نوکلئیک مطالعه می‌شوند. پس از خواندن این مطلب درک خواهید کرد که چگونه ژنتیک مولکولی می‌تواند بر سلامت جامعه تأثیر بگذارد و به افزایش کیفیت زندگی بشر کمک کند.

ژنتیک مولکولی چیست؟

در معنای لغوی، ژنتیک مولکولی شاخه‌ای از ژنتیک است که با ساختار و عملکرد ژن‌ها در سطح مولکولی سروکار دارد. اصطلاح ژنتیک مولکولی گاهی اوقات به یک نظریه بنیادی اشاره دارد که ادعا می‌کند ژن‌ها تمام فرآیندهای حیات را از طریق تولید پلی پپتیدها (پروتئین‌ها) هدایت می‌کنند، گاهی اوقات به یک تئوری اساسی نسبتاً کمتری در مورد بیان و تنظیم ژن‌ها در سطح مولکولی و گاهی اوقات به یک روش تحقیقاتی اطلاق می‌شود که مبتنی بر استراتژی‌های تحقیقاتی در نظریه اساسی ژن‌ها است.

ژنتیک مولکولی یک زیرشاخه از زیست‌شناسی است که به چگونگی بروز تغییرات در ساختارهای اسید نوکلئیک یا بیان مولکول‌های DNA و متعاقب آن تغییر در فنوتیپ موجودات می‌پردازد. ژنتیک مولکولی اغلب برای تعیین ساختار یا عملکرد ژن‌ها در ژنوم ارگانیسم با استفاده از صفحه‌های ژنتیکی انجام می‌شود. ژنتیک مولکولی ادغام چندین زیر شاخه در زیست‌شناسی شامل وراثت کلاسیک مندلی، زیست‌شناسی سلولی، زیست‌شناسی مولکولی، بیوشیمی و بیوتکنولوژی است.

محققان به دنبال جهش در یک ژن یا ایجاد جهش در یک ژن برای کشف ارتباط بین توالی ژن با یک فنوتیپ خاص هستند. ژنتیک مولکولی یک روش قدرتمند برای ارتباط جهش‌ها با شرایط ژنتیکی است که ممکن است به جستجو و کشف درمان‌های مختلف بیماری‌های ژنتیکی کمک کند.

تاریخچه ژنتیک مولکولی

برای توسعه ژنتیک مولکولی به عنوان یک رشته، چندین کشف علمی لازم بود. کشف DNA به عنوان وسیله‌ای برای انتقال کد ژنتیکی زندگی از یک سلول به سلول دیگر و بین نسل‌ها برای شناسایی مولکول مسئول وراثت ضروری بود. واتسون و کریک (در رابطه با فرانکلین و ویلکینز) ساختار DNA، سنگ بنای ژنتیک مولکولی را کشف کردند. جداسازی اندونوکلئاز محدودکننده در باکتری اشرشیا کولی (E. coli) توسط ورنر اربر، دانیل ناتانز و همیلتون اسمیت (Werner Arber ،Daniel Nathans ،Hamilton Smith) در سال 1969 زمینه مهندسی ژنتیک را باز کرد. از آنزیم‌های محدودکننده برای تعیین خطی DNA برای جداسازی توسط الکتروفورز و ساترن بلات برای شناسایی بخش‌های DNA خاص از طریق پروب‌های هیبریداسیون استفاده شد.

در سال 1971 برگ با استفاده از آنزیم‌های محدود کننده اولین مولکول DNA نوترکیب و اولین پلاسمید DNA نوترکیب را ایجاد کرد. در سال 1972 کوهن و بویر با قرار دادن پلاسمیدهای DNA نوترکیب در E. coli که اکنون به عنوان تحول باکتریایی شناخته می‌شود، اولین ارگانیسم DNA نوترکیب را ایجاد و زمینه را برای شبیه‌سازی مولکولی فراهم کردند. توسعه تکنیک‌های تعیین توالی DNA در اواخر دهه 1970، ابتدا توسط ماکسام و گیلبرت و سپس توسط فردریک سنگر، در تحقیقات ژنتیکی مولکولی بسیار مهم بود و دانشمندان را قادر به انجام صفحه‌های ژنتیکی برای ارتباط توالی‌های ژنوتیپی به فنوتیپ‌ها کرد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با استفاده از آنزیم پلیمراز Taq که توسط مولیس در سال 1985 اختراع شد، دانشمندان را قادر ساخت میلیون‌ها نسخه از توالی DNA خاص را که می‌تواند برای تغییر شکل استفاده شود یا با استفاده از جداسازی ژل آگارز دستکاری کند. یک دهه بعد، اولین ژنوم کامل توالی‌یابی شد و متعاقباً توالی یابی ژنوم انسانی از طریق پروژه ژنوم انسانی در سال 2001 انجام گرفت. نقطه اوج همه این اکتشافات، حوزه جدیدی به نام ژنومیکس بود که ساختار مولکولی یک ژن را به پروتئین یا RNA رمزگذاری شده توسط آن بخش DNA و بیان عملکردی آن پروتئین در داخل ارگانیسم پیوند می‌دهد.

امروزه از طریق استفاده از تکنیک‌های ژنتیکی مولکولی، ژنومیک در بسیاری از موجودات مدل در حال بررسی است و داده‌ها در پایگاه داده‌های رایانه‌ای مانند NCBI و Ensembl جمع‌آوری می‌شوند. تجزیه و تحلیل رایانه‌ای و مقایسه ژن‌ها در داخل و بین گونه‌های مختلف، بیوانفورماتیک نامیده می‌شود و جهش‌های ژنتیکی را در مقیاس تکاملی به هم پیوند می‌دهد.

کاربرد ژنتیک مولکولی چیست؟

از ژنتیک مولکولی برای تولید محیط کشت باکتری‌ها، مطالعات بالینی در زمینه تولید واکسن، تولید حیوانات تراریخت برای مطالعه در زمینه بیماری‌ها و داروها یا تولید محصولات غذایی بیشتر و با کیفیت‌تر و تولید حیوانات تراریخت با صفات جدید استفاده می‌شود که نمی‌توان آن‌ها را از طریق استراتژی‌های استاندارد تولید مثل طی چندین نسل به دست آورد. در کشاورزی و زراعت نیز ژنتیک مولکولی در تولید گیاهانی با ویژگی‌های مطلوب مانند مقاومت به شرایط سخت، تولید محصول بیشتر و مقاومت نسبت به آفات کشاورزی اشاره کرد.

همچنین ژنتیک مولکولی برای شناسایی جهش‌ها یا مارکرهای ژنتیکی مرتبط کاربرد دارد که باعث تفاوت در فنوتیپ‌ها می‌شوند. دانش ژنتیک مولکولی انقلابی در زندگی ایجاد کرده است. از زمانی که واتسون و کریک برای اولین بار پیشنهاد کردند که DNA، ماده ژنتیکی همه ارگانیسم‌ها، مارپیچی مضاعف است، طی نیم قرن اخیر روش‌های متنوعی برای مطالعه این ساختار ایجاد شده‌اند. به عنوان مثال، محققان با استفاده از تکنیک‌های شبیه‌سازی مولکولی که در دهه 1970 توسعه یافتند، توانستند نسخه‌های زیادی از ژن‌های موردنظر خود را تولید و عملکرد آن‌ها را مطالعه کنند. این روش‌ها به ویژه هنگام مطالعه بیماری‌های ارثی ژنتیکی مانند سرطان، بسیار مفید هستند و پیشرفت در این زمینه منجر به ایجاد دانش بیوتکنولوژی شده است.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا PCR روشی است که با استفاده از آن تعداد بسیار زیادی کپی از یک قطعه DNA تولید می‌شوند. پیدایش و توسعه انواع PCR نه تنها تأثیر زیادی در پژوهش‌های ژنتیک مولکولی داشته است بلکه در پزشکی، تشخیص و حتی پزشکی قانونی و جُرم شناسی کاربردهای فراوانی دارد. انگشت‌نگاری DNA یکی از مهمترین ابزارها برای تشخیص و ردیابی مجرمین و مظنونین جنایی است. از آنجایی که DNA هر فرد در اثر انگشت ژنتیکی به قطعات تقسیم می‌شود، الگوی منحصر به فردی ایجاد می‌کند و شناسایی با این روش بسیار قابل اعتماد است.

بهبود و اصلاح ژنتیکی، یکی دیگر از  کاربردهای ژنتیک مولکولی است که هدف آن بهبود تولید گیاهان و پرورش حیوانات بهینه، برای مصرف انسان است. یکی دیگر از کاربردهای نسبتاً جدید ژنتیک مولکولی، شبیه‌سازی حیوانات است که از طریق این فرآیند می‌توان نمونه‌های حیواناتی مانند گوسفند شبیه‌سازی شده را با روش‌های آزمایشگاهی تولید کرد. این تکنیک‌های جدید ژنتیک مولکولی مرزهای علم را پیش می‌برند اما در کنار آن، پژوهشگران این حوزه با بحث‌های اخلاقی جدیدی نیز روبرو هستند.

تکنیک های ژنتیک مولکولی

ژنتیک به طور خلاصه، مطالعه وراثت و تغییر صفات بیولوژیکی موجودات زنده است. انجام تحقیقات ژنتیکی بدون مطالعه مستقیم DNA هم امکان‌پذیر است. در واقع برخی از بزرگترین متخصصان ژنتیک دانش خاصی از DNA نداشتند اما در عوض تجزیه و تحلیل فنوتیپ‌ها، الگوهای وراثت و نسبت آن‌ها را با دقت مطالعه و بر اساس مشاهدات خود الگوهای وراثت را طراحی می‌کردند. امروزه ژنتیک کلاسیک با زیست‌شناسی مولکولی تکمیل و مباحث تخصصی آن در حوزه ژنتیک مولکولی ارائه می‌شوند

معمولاً آزمایش‌های ژنتیک مولکولی شامل ترکیبی از تکنیک‌ها برای جداسازی و تجزیه و تحلیل DNA یا RNA رونویسی شده از یک ژن خاص هستند. در برخی موارد، DNA ممکن است متعاقباً با جهش یا ترکیب مجدد با سایر قطعات DNA دست‌ورزی شود. تکنیک‌های ژنتیک مولکولی در بسیاری از زمینه‌های زیست‌شناسی و همچنین پزشکی قانونی، زیست فناوری و پزشکی کاربرد گسترده‌ای دارند.

تخلیص DNA

استراتژی‌های تخلیص DNA متکی بر خصوصیات شیمیایی DNA است که آن را از سایر مولکول‌های سلول متمایز می‌کند، چون یک مولکول بسیار بزرگ با بار منفی است. برای استخراج DNA خالص از یک نمونه بافت، سلول‌ها با خرد کردن یا لیز زدن در محلولی که حاوی مواد شیمیایی محافظت کننده از DNA است در حالی که سایر اجزای سلول را از بین می‌برد، شکسته می‌شوند. این مواد شیمیایی ممکن است شامل مواد شوینده‌ای باشد که غشای چربی و پروتئین‌های دناتوره را حل می‌کند.

یک کاتیون مانند سدیم به ایجاد ثبات DNA با بار منفی و جدا کردن آن از پروتئین‌هایی مانند هیستون کمک می‌کند. یک عامل کلاته کننده، مانند EDTA برای محافظت از DNA با جداسازی یون‌های منیزیم اضافه می‌شود که در غیر این صورت می‌تواند به عنوان یک کوفاکتور مشترک لازم برای نوکلئازها (آنزیم‌هایی که DNA را هضم می‌کنند) باشد. در نتیجه مولکول‌های DNA دو رشته‌ای آزاد از کروماتین به داخل بافر استخراج آزاد می‌شوند که حاوی پروتئین و سایر اجزای سلولی است. مولکول‌های DNA آزاد متعاقباً توسط یکی از چندین روش جدا می‌شوند.

معمولاً پروتئین‌ها با تنظیم غلظت نمک، بنابراین رسوب می‌یابند. سپس مایع رویی که حاوی DNA و سایر متابولیت‌های کوچکتر است، با اتانول مخلوط می‌شود که باعث رسوب DNA می‌شود. یک گلوله کوچک از DNA را می‌توان با سانتریفوژ جمع آوری کرد و پس از حذف اتانول، DNA را می‌توان در آب حل کرد (معمولاً با مقدار کمی EDTA و بافر pH) برای استفاده در واکنش‌های دیگر. این فرایند تمام DNA را از یک نمونه بافت تخلیص کرده است. برای جداسازی یک ژن یا قطعه خاص از DNA، باید از تکنیک‌های اضافی مانند PCR استفاده کرد.

PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز روشی برای همانندسازی DNA است که در لوله آزمایش و در شرایط آزمایشگاهی انجام می‌شود. در اینجا پلی مراز به آنزیمی DNA پلیمراز استخراج شده و از باکتری‌ها خالص می‌شود و واکنش زنجیره‌ای به توانایی این روش برای تولید میلیون‌ها نسخه از یک مولکول DNA اشاره دارد، با استفاده از هر مارپیچ دوتایی که به تازگی تکثیر شده است به عنوان الگویی برای سنتز دو مارپیچ دوتایی جدید DNA. بنابراین PCR یک روش بسیار کارآمد برای تکثیر DNA است.

اکثر DNA پلیمرازها فقط می‌توانند نوکلئوتیدها را به انتهای رشته موجود DNA اضافه کنند و بنابراین برای شروع روند همانندسازی به یک آغازگر یا پرایمر نیاز دارند. برای PCR از پرایمرهایی با حدود 20 نوکلئوتید استفاده می‌شود. در یک PCR ایده آل، پرایمرها فقط به ترتیب مکمل دقیق خود روی رشته الگو هیبرید می‌شوند. طراحی اختصاصی پرایمرها برای یک ناحیه خاص از DNA، باعث تولید و تکثیر ناحیه مورد نظر خواهد شد.

برای PCR تمام اجزای لازم برای همانندسازی DNA، از جمله DNA پلیمراز و محلول حاوی نوکلئوتیدها (dATP ،dCTP ،dGTP ،dTTP)، DNA الگو، محلول پرایمر DNA، بافر و یون (به عنوان مثال منیزیم) مورد نیاز پلیمراز در یک ویال کوچک ترکیب می‌شوند. PCR موفق فقط با استفاده از یک مولکول DNA به عنوان الگو انجام شده است اما در عمل، واکنش PCR حاوی هزاران مولکول الگو است. DNA الگو معمولاً قبلاً با استفاده از تكنيک‌های توضيح داده شده از سلول‌ها يا بافت‌ها تخلیص شده است. با این حال، در بعضی شرایط می‌توان سلول‌های کامل را مستقیماً در واکنش PCR قرار داد تا به عنوان الگو استفاده شوند.

برش و اتصال DNA

بسیاری از باکتری‌ها دارای آنزیم‌هایی هستند که توالی‌های DNA مشخص را تشخیص می‌دهند و سپس مارپیچ DNA دو رشته‌ای را در این توالی قطع می‌کنند. به این آنزیم‌ها اندونوکلئازهای محدودکننده اختصاصی یا به عبارت ساده‌تر آنزیم‌های محدودکننده گفته می‌شود و به طور طبیعی به عنوان بخشی از دفاع باکتریایی در برابر ویروس‌ها و سایر منابع DNA خارجی عمل می‌کنند. برای برش DNA در مکان‌های شناخته شده، محققان از آنزیم‌های محدود کننده گونه‌های مختلف باکتریایی استفاده می‌کنند که امروزه می‌توان آن‌ها را از شرکت‌های تجاری مختلف خریداری کرد.

این آنزیم‌ها معمولاً بر اساس نام باکتری که برای اولین بار از آن جدا شده‌اند نامگذاری می‌شوند. به عنوان مثال EcoRI و EcoRV هر دو آنزیم E. coli هستند. EcoRI DNA دو رشته‌ای را در توالی GAATTC برش می‌دهد. انتهای یک مولکول برش داده شده توسط EcoRI یک منطقه تک رشته‌ای است که انتهای چسبنده نام دارد. EcoRV نمونه‌ای از آنزیمی است که دقیقاً در وسط توالی تشخیص خود، هر دو رشته را قطع کرده و انتهای صاف یا بلانت اند (Blunt End) ایجاد می‌کند. انتهای صاف ایجاد می کند. این آنزیم توالی پالیندرومی دارای ۶ باز  ‘GAT | ATC – 3 را تشخیص می‌دهد.

فرآیند اتصال DNA زمانی اتفاق می‌افتد که رشته‌های DNA با پیوند کووالانسی به هم متصل شوند و از طریق عملکرد آنزیمی به نام DNA لیگاز از انتها به انتها متصل می‌شوند. گفته می‌شود که مولکولهای چسبناک و دارای توالی تعویض مکمل دارای انتهای سازگار هستند که اتصال آن‌ها را برای تشکیل DNA نوترکیب تسهیل می‌کند. به همین ترتیب، دو توالی انتهای بلانت نیز برای در هم آمیختن سازگار در نظر گرفته می‌شوند، اگرچه آن‌ها به اندازه انتهای چسبنده به هم متصل نمی‌شوند. مولکول‌های انتهای چسبنده با توالی‌های غیر مکمل با DNA لیگاز متصل نخواهند شد. پیوند در تولید DNA نوترکیب، از جمله قرار دادن قطعه DNA دو رشته‌ای در یک وکتور پلاسمیدی، مهم است.

تکثیر DNA با پلاسمید

بسیاری از باکتری‌ها حاوی DNA خارج کروموزومی به نام پلاسمید هستند. پلاسمیدها مولکول‌های حلقوی کوچکی (با 1000 جفت باز) هستند که به طور مستقل از کروموزوم تکثیر می‌شوند و می‌توانند با تعداد کپی زیاد در سلول وجود داشته باشند. در طبیعت، پلاسمیدها می‌توانند طی جفت‌گیری باکتریایی بین افراد و حتی گاهی بین گونه‌های مختلف منتقل می‌شوند. پلاسمیدها غالباً ژن‌های بیماری‌زایی و مقاومت به دارو را حمل می‌کنند، بنابراین در پزشکی از اهمیت ویژه‌ای برخوردار هستند. در آزمایشگاه، پلاسمیدها را می‌توان در فرآیندی به نام ترانفورماسیون، به درون باکتری‌ها منتقل کرد.

استفاده از پلاسمید به عنوان وکتور

برای قرار دادن قطعه DNA در پلاسمید، قطعه مورد نظر و پلاسمید حلقوی با استفاده از یک آنزیم محدودکننده که انتهای سازگار تولید می‌کند، برش داده می‌شوند. با توجه به تعداد زیادی آنزیم محدودکننده که در حال حاضر در دسترس است، یافتن آنزیمی که توالی‌های شناسایی مربوطه در آن در پلاسمید و قطعه DNA هدف وجود داشته باشد، معمولاً خیلی دشوار نیست، خصوصاً به دلیل اینکه اکثر وکتورهای پلاسمید مورد استفاده در ژنتیک مولکولی برای داشتن نواحی شناسایی تعداد زیادی از اندونوکلئازهای محدود کننده مهندسی شده‌اند.

پس از هضم محدود، قطعات مورد نظر ممکن است قبل از مخلوط شدن با لیگاز، بیشتر خالص سازی یا انتخاب شوند تا به هم متصل شوند. پلاسمیدهای تازه لیگاند شده، حاوی ژن مورد علاقه، به E. coli تبدیل می‌شوند. تحول با مخلوط کردن DNA لیگاند شده با سلول‌های E. coli که به طور ویژه برای جذب DNA آماده شده‌اند انجام می‌شود. سلول‌های حامل پلاسمید را می‌توان با قرار گرفتن در معرض ترکیباتی مانند CaCl2 یا در میدان‌های الکتریکی (الکتروپوراسیون) ایجاد کرد.

از آنجا که تنها بخش کوچکی از سلول‌ها که با DNA مخلوط می‌شوند در حقیقت تغییر شکل می‌دهند، یک مارکر قابل انتخاب مانند ژن برای مقاومت به آنتی‌بیوتیک، معمولاً در پلاسمید نیز وجود دارد. پس از تغییر شکل (ترکیب DNA با سلول‌های مناسب)، باکتری‌ها در صفحه آگار باکتریایی حاوی یک آنتی‌بیوتیک مناسب پخش می‌شوند به طوری که فقط آن دسته از سلول‌هایی که واقعاً پلاسمید را در خود جای داده‌اند، قادر به رشد و تشکیل کلونی هستند. سپس می‌توان این مورد را انتخاب و برای مطالعه بیشتر مورد استفاده قرار داد.

متخصصان ژنتیک مولکولی از پلاسمیدها به عنوان وکتور برای حمل، تقویت، انتقال و گاهی بیان ژن‌های مورد نظر که در DNA شبیه‌سازی شده وجود دارند، استفاده می‌کنند. غالباً، اولین قدم در یک آزمایش ژنتیک مولکولی کلون‌ کردن یک ژن به یک پلاسمید است، سپس این پلاسمید نوترکیب را دوباره به باکتری منتقل می‌کنیم تا در اصل نسخه‌های نامحدود ژن (و پلاسمید حامل آن) همزمان با تکثیر باکتری، تکثیر شوند. این یک ضرورت عملی برای دستکاری بیشتر DNA است، زیرا اکثر تکنیک‌های ژنتیک مولکولی آنقدر حساس نیستند که بتوانند همزمان فقط با یک مولکول کار کنند. بنابراین بسیاری از آزمایشات شبیه‌سازی مولکولی و نوترکیبی فرآیندهای تکراری هستند که در آن‌ها:

• یک قطعه DNA (که معمولاً توسط PCR یا هضم محدود جدا می‌شود) در یک برش پلاسمید با یک آنزیم محدود سازگار کلون می‌شود.
• پلاسمید نوترکیب به باکتری منتقل می‌شود.
• باکتری‌ها معمولا در محیط کشت مایع تکثیر می‌شوند.
• مقدار زیادی از DNA پلاسمید نوترکیب از محیط کشت باکتری جدا شده می‌شود.
• دست‌ورزی بیشتر در پلاسمید نوترکیب انجام می‌شود.
• پلاسمید تغییر یافته قبل از دست‌ورزی بیشتر یا برای بیان، دوباره به باکتری منتقل می‌شود.

آنالیز DNA با ژل الکتروفورز

محلول DNA بی رنگ است و به جز اینکه در غلظت زیاد چسبناک باشد، از نظر آب از نظر آب قابل تشخیص نیست. بنابراین، تکنیک‌هایی مانند الکتروفورز ژل برای شناسایی و تجزیه و تحلیل DNA ایجاد شده است. این تجزیه و تحلیل زمانی شروع می‌شود که محلول DNA در یک انتهای ژل رسوب کند. این ژل از پلیمرهایی مانند آگارز که یک پلی ساکارید جدا شده از جلبک دریایی است، ساخته می‌شود. سپس DNA توسط یک جریان الکتریکی از طریق ژل مجبور می‌شود، و مولکول‌های DNA به سمت الکترود مثبت حرکت می‌کنند.

هنگام مهاجرت، هر قطعه DNA از طریق منافذی که در بین پلیمرهای موجود در ژل وجود دارند، جدا می‌شود. از آنجا که قطعات کوتاهتر می توانند سریعتر از قطعه‌های بلند در این منافذ حرکت کنند، ژل الکتروفورز مولکول‌ها را بر اساس اندازه (طول) آن‌ها جدا می‌کند، قطعات DNA کوچکتر با سرعت بیشتری نسبت به قطعات طولانی حرکت می‌کنند. مولکول‌های DNA با اندازه مشابه در هر ژل به مکانی مشابه مهاجرت می‌کنند. این ویژگی دیدن DNA را پس از رنگ‌آمیزی DNA با یک رنگ فلورسنت مانند اتیدیوم بروماید آسان می‌کند. البته بر اساس اهداف مختلف و برای جداسازی مولکول‌های متفاوت، الکتروفورز نیز انواع مختلفی دارد.

با جداسازی مخلوطی از مولکول‌های DNA با اندازه شناخته شده (نشانگرهای اندازه) در مسیرهای مجاور روی همان ژل، می‌توان طول قطعه DNA غیر مشخص را تخمین زد. بخش‌های ژل حاوی باندهای DNA را نیز می‌توان از ژل جدا کرد و DNA انتخاب شده را اندازه‌گیری کرد و در انواع دیگر واکنش‌ها مانند تعیین توالی و شبیه سازی استفاده کرد.