تکنیک, وسترن بلات (Western Blotting)

وسترن بلات (Western Blotting)

وسترن بلاتینگ یا ایمونوبلاتینگ

یک تکنیک بسیار پرکاربرد و مرسوم در زمینه تشخیص پروتئین ها در حوزه بیولوژی مولکولی می باشد. در ابتدا مولکول های پروتئین با استفاده از تکنیک SDS-PAGE جدا می شوند و سپس جهت تشخیص نهایی و دقیق پروتئین مورد نظر از تکنیک وسترن بلات استفاده می شود. در این تکنیک ژل SDS-PAGE را با یک غشا از جنس نیتروسلولز و یا PVDF جفت نموده و جهت جریان دستگاه وسترن بلات را جوری تنظیم نموده که پروتئین ها از ژل SDS PAGE به سمت غشا حرکت نمایند.

اصطلاح “بلات” به انتقال نمونه های بیولوژیکی از یک ژل به یک غشاء و تشخیص بعدی آنها بر روی سطح غشا اشاره دارد. یک آزمایش وسترن بلات یا وسترن بلات (که به آن ایمونوبلات نیز گفته می شود، زیرا یک آنتی بادی به طور خاص برای تشخیص آنتی ژن آن استفاده می شود) توسط Towbin و همکارانش معرفی شد. در سال 1979 و در حال حاضر یک روش معمول برای تجزیه و تحلیل پروتئین است. ویژگی تعامل آنتی بادی-آنتی ژن، پروتئین هدف را قادر می سازد تا در میان یک مخلوط پروتئین پیچیده شناسایی شود. وسترن بلات می تواند داده های کیفی و نیمه کمی در مورد پروتئین مورد نظر تولید کند.

جداسازی الکتروفورتیک پروتئین ها

الکتروفورز ژل تکنیکی است که در آن مولکول های باردار، مانند پروتئین یا DNA، با توجه به خواص فیزیکی از هم جدا می شوند، زیرا آنها توسط جریان الکتریکی از طریق ژل عبور می کنند. پروتئین ها معمولاً با استفاده از الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) برای مشخص کردن پروتئین های منفرد در یک نمونه پیچیده یا بررسی پروتئین های متعدد در یک نمونه واحد جدا می شوند. هنگامی که با وسترن بلات ترکیب می شود، PAGE یک ابزار تحلیلی قدرتمند است که اطلاعاتی در مورد جرم، بار، خلوص یا وجود یک پروتئین ارائه می دهد. اشکال مختلفی از PAGE وجود دارد و می تواند انواع مختلفی از اطلاعات را در مورد پروتئین(های) مورد نظر ارائه دهد. به عنوان مثال، PAGE غیردناتوره یا PAGE بومی، پروتئین ها را بر اساس نسبت بار جرمی آنها جدا می کند. در مقابل، سدیم دودسیل سولفات-PAGE یا SDS-PAGE، پروتئین ها را بر اساس جرم به دلیل بار منفی وارد شده به پروتئین های متصل به شوینده یونی SDS جدا می کند.در اغلب موارد انتقال پروتئین از غشا به ژل با کمک نیروی الکتریکی صورت می گیرد. این نوع انتقال به انتقال الکتروفورزی معروف است. انتقال الکتروفورزی به دو صورت انجام می شود: انتقال در تانک که به انتقال تر معروف است و انتقال به روش نیمه خشک. البته می­توان به طریق انتشار با خاصیت مویینگی یا پمپ خلا نیز پروتئین ها را انتقال داد. پس از انتقال پروتئینها به غشا, با استفاده از آنتی بادی مخصوص پروتئین هدف شروع به رنگ آمیزی غشا نموده. در صورت وجود پروتئین هدف, با ایجاد رنگ پروتئین مورد نظر تشخیص داده می شود. از جمله آیتمهایی که در این بین مهم هستند ایجاد بستری جهت انتقال یکنواخت و یونیفرم و بدون تغییر دما جهت نیل به بهترین نتایج می باشد.

 

مراحل وسترن بلات چیست؟

شش مرحله در وسترن بلات وجود دارد:

آماده سازی نمونه

الکتروفورز ژل

انتقال پروتئین

مسدود کردن

انکوباسیون آنتی بادی

تشخیص

تجسم پروتئین

تفاوت بین SDS-PAGE و وسترن بلات چیست؟

SDS-PAGE یک روش الکتروفورز است که پروتئین ها را بر حسب جرم جدا می کند. وسترن بلات یک تکنیک تحلیلی برای شناسایی وجود یک پروتئین خاص در مخلوط پیچیده ای از پروتئین ها است که در آن الکتروفورز ژل معمولاً به عنوان اولین مرحله در فرآیند جداسازی پروتئین مورد نظر استفاده می شود.

 

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *