13. دوره جامع ارشد مهندسی ژنتیک (کلونینگ) و دوره جامع کشت سلول (رده سلول سرطانی)

دوره جامع ارشد مهندسی ژنتیک (کلونینگ) و دوره جامع کشت سلول (رده سلول سرطانی)

کلونینگ چیست ؟

به فرآیندی اطلاق می‌شود که طی آن مولکول‌های DNA  نوترکیب تولید و به یک ارگانیسم میزبان انتقال داده شده و در آنجا تکثیر می‌یابند. کلونینگ بصورت کلی یعنی به معنای ایجاد کپی‌های یکسان از محصول مورد نظر است.

یک فرایند کلونینگ مولکولی معمولاً شامل دو جزء اصلی زیر می‌باشد:

• قطعه DNA مورد نظر
• وکتور/ پلاسمید که شامل اجزاء لازم برای تکثیر در ارگانیسم میزبان است.

ژن مورد نظر ( ژن هدف ) می‌تواند یک ژن، عناصر تنظیم‌کننده یا اپرون، یک پروموتر یا هر قطعه دیگری باشد. که آن را می‌توان با روش‌های مختلفی برای کلون کردن آماده کرد. DNA مورد نظر را می‌توان با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده از یک منبعِ DNAی دیگر مانند وکتور/ پلاسمید یا DNA ژنومی برش زد. با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، قطعه DNAی مورد نظر را می‌توان تکثیر کرد. قطعه  DNA مورد نظر را می‌توان با به هم چسباندن اولیگونوکلئوتیدهای تک رشته‌ای مونتاژ کرد.

پلاسمید (پلازمید) یک قطعه کوچک و حلقوی از DNA است که در داخل سلول میزبان مجزا از DNA کروموزومی یا ژنومی تکثیر می‌یابد. اغلب پلاسمیدهای رایج مورد استفاده در تکنولوژیِ DNA نوترکیب، به منظور مطالعه و دستکاری ژن‌ها بهینه شده‌اند. به عنوان مثال بیشتر پلاسمیدها در باکتری E. coli  تکثیر می‌شوند و دارای اندازه‌ی نسبتاً کوچک (∼ 3000 تا 6000 جفت باز) می باشند که برای دستکاری آسان می‌باشند. فرآیند کلونینگ مولکولی به دانشمندان این امکان را می‌دهد تا کروموزوم‌ها و ژن‌ها را مورد مطالعه قرار دهند.

امروزه دانشمندان می‌توانند ژن‌ها و سایر عناصر ژنتیکی را به راحتی با استفاده از پلاسمیدهایی که بطور خاص مهندسی شده‌اند، مورد مطالعه و دستکاری قرار دهند و به این ترتیب پلاسمیدها تبدیل به ابزارهای قدرتمندی در ژنتیک مولکولی شده‌اند.

کاربرد کلونینگ:

• به دست آوردن توالی یک ژن خاص
• آنالیز توالی  DNA
• بررسی عملکرد یک آنزیم،RNA  یا پروتئین
• بررسی جهش موجود در یک ژن

تکنیک ها

• مبانی مهندسی ژن:

به‌عنوان بخشی از دانش زیست فناوری؛ به مجموعه روش‌هایی گفته می‌شود که به منظور جداسازی، خالص‌سازی، وارد کردن و بیان یک ژن خاص در یک میزبان بکار می‌روند و نهایتاً منجر به بروز یک صفت خاص یا تولید محصول مورد نظر در جاندار میزبان می‌شود. کاربردهای مهندسی ژنتیک تقریباً نامحدود به نظر می‌رسد. این علم کاربردهای زیادی در علوم پایه، داروسازی، علوم دامی، تولیدات دامی، کشاورزی و علوم پزشکی دارد. در زمینه علوم پایه، بررسی‌هایی مانند مکانیسم‌های همانندسازی DNA و بیان ژن‌ها در پروکاریوت ها، یوکاریوت ها و ویروس ها و همچنین چگونگی ساخته شدن و تغییرات پروتئین‌های داخلی سلول و همچنین سازوکار ایجاد سرطان از جمله کاربردهای مهندسی ژنتیک است.

• آشنایی با انواع وکتورها:

پلاسمید “Plasmid vector“

کاسمید “Cosmid“

باکتریوفاژ “Bacteriophage vector“

کروموزوم مصنوعی باکتریایی “Bacterial artificial chromosome“

کروموزوم مصنوعی مخمر “Yeast artificial chromosome

کروموزوم مصنوعی انسان “Human artificial chromosome“

ناقلان ویروسی، حیوانی و گیاهی “Animal and plant viral vectors“

• آموزش ساخت محیط کشت، تکثیر و ذخیره سازی باکتری

محیط کشت باکتری باید به گونه‌ای تهیه شود که قبل از تلقیح با یک باکتری خاص، استریل باشد تا تنها نوع باکتری موجود در نمونه باشد. محیط کشت باید هر آنچه باکتری برای تکثیر نیاز دارد را فراهم کند، بنابراین دما، اسیدیته، نوع بستر، مواد غذایی و اکسیژن اهمیت دارند. تعداد محیط موجود برای رشد باکتری قابل توجه است. برخی از محیط‌های کشت عمومی از رشد طیف وسیعی از ارگانیسم ها پشتیبانی می‌کنند. یک نمونه برجسته از یک محیط همه منظوره، آبگوشت سویا آزمایشگاهی (TSB) است.

از محیط‌های تخصصی در شناسایی باکتری‌ها استفاده می‌شود و با رنگ‌ها، شاخص‌های PH یا آنتی بیوتیک ها تکمیل می‌شود. یک نوع ماده غنی شده شامل فاکتورهای رشد، ویتامین ها و سایر مواد مغذی ضروری برای رشد ارگانیسم‌های سریع‌الرشد است، ارگانیسم‌هایی که نمی‌توانند مواد مغذی خاصی ایجاد کنند و نیاز به افزودن آن‌ها به محیط دارند.

• تکثیر پلازمید

از پلازمیدها در مهندسی ژنتیک برای تکثیر یا بیان ژن یا ژن‌های خاصی استفاده می‌شود. برای این کار، ژن مورد نظر را وارد پلازمید می‌کنند. این نوع از پلازمیدها به‌طور معمول دارای یک ژن مقاومت آنتی‌بیوتیکی (برای غربالگری) و یک جایگاه کلونینگ چندگانه (به انگلیسی: multiple cloning site ) یا polylinker است.

• تخلیص پلازمید

خالص سازی پلازمید تکنیکی است که به منظور جداسازی و خالص نمودن DNA پلازمیدی از DNA ژنومی ،پروتئین ها،ریبوزوم ها ، و دیواره سلولی باکتریایی به کار میرود . پلاسمید ،DNA دو رشته ای ، حلقوی ، کوچک میباشد که به عنوان حامل برای مولکول های DNA خاص به کار می رود. زمانی که از طریق ترانسفورمیشن به یک ارگانیسم میزبان عرضه میشود، یک پلازمید همانندسازی خواهد کرد، و نسخه های متعدد از قطعه  DNA تحت مطالعه به وجود می آیند.

• هضم آنزیمی

آنزیم های محدودکننده توالی خاصی از DNA دو رشته ای را برش میزنند. تکنیک زیر می تواند مورد استفاده قرار گیرد تا هر قطعه DNA به راحتی منتقل شود، این تکنیک درحالتی کاربرد دارد که محل برش آنزیم ها در دو طرف ژن مورد نظر بوده و مکمل آنها را بتوان در محل مناسبی از وکتور ایجاد کرد تا بتوان ژن را به درون پلازمید منتقل کرد.

آنزیم های محدودکننده (اندونوکلئازهای محدودکننده) پروتئین هایی هستند که DNA را در (یا نزدیک به) مکان های شناسایی خاص برش میزنند. دو نوع آنزیم محدود کننده وجود دارد که در نحوه قطع DNA هدف متفاوت عمل میکنند:

• برش با ایجاد انتهای بلانت: این آنزیم های محدودکننده هر دو رشته DNA هدف را در یک نقطه بریده و انتهای صاف ایجاد می کنند.
• برش با ایجاد انتهای چسبنده: این آنزیم های محدودکننده هر دو رشته DNA هدف را در نقاط مختلف برش می دهند و 3′- یا 5′- آزاد و 1 تا 4 نوکلئوتید (به اصطلاح انتهای چسبنده) ایجاد می کنند.

• لیگاسیون

لیگاسیون به معنای بستن رگ‌ها به روش جراحی از طریق یک برش کوچک در پوست می‌باشد تا از جمع شدن خون در رگ جلوگیری به عمل آید. عمل جراحی لیگاسیون ممکن است همراه با عمل استریپینگ یا برش و برداشتن اعمال شود.

• تهیه باکتری مستعد (competent cell)

مستعد کردن از مراحل مهم کلونینگ است و باید با دقت لازم انجام شود که برای وارد کردن توالی خارجی به داخل سلول میزبانش استفاده می‌شود.

• ترانسفورماسیون (انتقال وکتور به درون سلول)

انتقال افقی ژن (به انگلیسی: Horizontal gene transfer، به طور مخفف HGT) که به نام (به انگلیسی: Lateral gene transfer، به طور مخفف LGT) هم شناخته می‌شود، به انتقال ماده ژنتیکی میان جانداران در مسیری غیر از انتقال عمودی ژن‌ها (به انگلیسی: vertical transfer) می‌گویند. در انتقال عمودی ژن‌ها، ماده ژنتیکی از والد به فرزندان انتقال پیدا می‌کند. انتقال افقی ژن‌ها یکی از مهم‌ترین عوامل مقاومت آنتی‌بیوتیکی در باکتری‌ها است. از انتقال افقی ژن‌ها در مهندسی ژنتیک نیز استفاده می‌شود. برای مثال باکتری‌های تجزیه کننده سموم کشنده آفات گیاهی. چند سازوکار مختلف برای انتقال افقی ژن‌ها وجود دارد:

• ترانسفورماسیون (به انگلیسی: Transformation): سلول، ماده ژنتیکی بیگانه (DNA یا RNA) را برداشته (وارد خود می‌سازد) و آن را بیان می‌کند. این پدیده بیشتر در باکتری‌ها دیده شده‌است و کمتر در یوکاریوت‌ها مشاهده می‌شود. در آزمایشگاه‌های ژنتیک، از ترانسفورماسیون برای ورود ژن‌های جدید به داخل باکتری جهت مصارف صنعتی یا بیوتکنولوژی استفاده می‌گردد.
• ترانس‌داکشن (به انگلیسی: Transduction): فرایندی است که در آن، DNAی باکتریایی از یک باکتری به باکتری دیگر از طریق فاژ (باکتریوفاژ) منتقل می‌شود.
• هم یوغی یا کونژوگاسیون (به انگلیسی: conjugation): فرایندی است که ماده ژنتیکی از طریق تماس مستقیم دو باکتری با هم صورت می‌گیرد. در این فرایند، باکتری نر با استفاده از پیلی جنسی به باکتری ماده می‌چسبد و سپس ماده ژنتیکی مربوطه را به باکتری ماده منتقل می‌کند.

ترانسفورماسیون گیاهان مستلزم داشتن بافت گیاهی سالم با رشد و تقسیم سریع می‌باشد.

• جداسازی و گزینش کلون ها

تولید هرچه بیشتر متابولیت های ثانویه توسط سلول های کشت شده حاصل از القاء کالوس از اهمیت خاصی برخوردار است. اخیرا با استفاده از روش های گزینش کلون توانسته اند نژادهای سلولی که مقادیر بیشتری آلکالوئید نسبت به سلول های گیاه طبیعی تولید می کنند را جداسازی نمایند. به دلیل هتروژن بودن سلول های گیاهی کشت شده، گزینش موفق سلول های تولید کننده مقادیر زیاد متابولیت ثانویه امکان پذیر گردیده است.

• تکثیر کلونها در سلول میزبان

کلونینگ مولکولی به فرآیندی اطلاق می‌شود که توسط آن مولکول‌های نوترکیب DNA تولید، به یک ارگانیسم میزبان انتقال داده شده، و در آنجا تکثیر می‌یابند. یک واکنش کلونینگ مولکولی معمولاً شامل بر دو جزء اصلی زیر می‌باشد:

۱- قطعه DNA مورد نظر یا اینسرت ( Insertیا DNA fragment of interest)؛
۲- وکتور/ پلاسمید که شامل تمام اجزاء لازم برای تکثیر در ارگانیسم میزبان است.

• استخراج از ژل و clean up

از کیت استخراج از ژل و تخلیص محصول PCR ، میتوانید جهت تخلیص قطعات DNA  از ژل آگارز ( با پایه  TAE  و یا TBE) و یا محصول PCR و یا دیگر واکنش های آنزیمی استفاده کنید. این کیت قادر به خالص سازی قطعات از 65bp تا 10kbp میباشد. همچنین این کیت توانایی ریکاوری  70 تا 85 درصد از ژل آگارز و 90 تا 95 درصد از محصول PCR  را دارد.

• ساخت آگارز

روش آماده سازی ژل آگارز برای الکتروفورز از بافر و پودر آگارز استفاده می شود. نسبت این دو بستگی مستقیمی به سایز و شکل DNA یا مولکول هایی که قرار است الکتروفورز شوند دارند. برای تهیه ژل آگارز ، معمولا پودر آگارز را در یک بافر مناسب حل می کنند؛ از جمله بافرهایی که برای این کار استفاده می شوند TAE و TBE را می توان نام برد. بافر TAE از تریس ، استیک اسید و EDTA تشکیل شده است و برای تنظیم اسیدیته محیط به کار می رودو غلظت آن در ژل و تانک الکتروفورز باید یکسان باشد تا حین برقراری جریان الکتریکی، تعادل یونی بین ژل و بافر تانک ایجاد شده و اختلالی در حرکت نمونه های DNA رخ ندهد. در بافر TBE به جای استیک اسید از اسید بوریک استفاده می شود. بافر TAE دارای کمترین ظرفیت بافری می باشد اما قدرت تفکیک آن برای مولکول های بزرگ DNA بسیار خوب می باشد. معمولا بافرهایی که حاوی EDTA هستند، جهت غیر فعالسازی انواع نوکلئازهایی که نیازمند کاتیون های دوظرفیتی جهت فعالیت خود می باشند، روش آماده سازی ژل آگارز برای الکتروفورز استفاده می کنند

• الکتروفورز

الکتروکوچ یا الکتروفورز (به انگلیسی: Electrophoresis) به حرکات ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی گویند. الکتروکوچ از شناخته شده‌ترین روش‌های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول‌ها است.

به سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند DNA و پروتئین ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آن‌ها در یک میدان الکتریکی، آن‌ها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بارالکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروکوچ استفاده می‌شود. روش‌های مختلف الکتروکوچی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین‌ها ابداع شده‌است.

به‌طورکلی الکتروکوچ حرکت ذرات پراکنده در داخل مایعی تحت تأثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. همین حرکت در فضایی با میدان الکتریکی غیریکنواخت دی‌الکتروکوچ نامیده می‌شود. الکتروکوچ تکنیکی است که برای جداسازی و در برخی مواقع خالص‌سازی ماکرومولکول‌ها به‌ویژه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه که در اندازه، بار و ترکیب متفاوتند، به کار می‌رود. زمانیکه مولکول‌های بارگذاری شده در یک میدان الکتریکی قرار می‌گیرند، بر اساس بار الکتریکی‌شان به سمت قطب مثبت (آند) یا منفی (کاتد) حرکت می‌کنند. سرعت حرکت مولکول‌ها در این شرایط نه تنها تحت تأثیر بار الکتریکی و شدت میدان الکتریکی است، بلکه عواملی نظیر اندازه، وزن مولکولی و شکل فضایی مولکول نیز در این امر دخیل هستند.

• آنالیز داده ها

تحلیل داده فرایند فهمیدن، پاک سازی، آماده‌سازی و تحلیل داده‌هاست که به منظور استخراج اطلاعات سودمند برای تصمیم گیری انجام می‌شود. منظور از تحلیل داده به فرایند ارزیابی داده با استفاده از ابزارهای آماری و تحلیلی است. هدف از این مهارت تعیین اطلاعات مفید و همچنین کمک به فرایند گرفتن تصمیمات مهم در کسب‌وکار است.

7 مرحله ی اساسی  کلونینگ یک ژن :

• جدا سازی قطعه ژن مورد نظر جهت کلونینگ
• وارد کردن ژن مورد نظر به داخل یک وکتور مناسب جهت ایجاد (recombinant DNA)
• وارد کردن recombinant DNA به داخل یک ارگانیسم مناسب ( میزبان )
• انتخاب سلول‌های میزبان ترنسفورم شده و شناسایی کلون‌های حاوی ژن مورد نظر
• تکثیر/بیان ژن هدف در سلول میزبان
• جداسازی کپی‌های ژنی تکثیر یافته/ پروتئین‌های بیان شده از ژن هدف
• خالص سازی و جداسازی قطعات ژنی/ پروتئینی

اجزای ضروری در کلونینگ وکتور

همه‌ی وکتورهای کلونینگ  DNA باید دارای یکسری خصوصیت مشترک باشند:

• باید توانایی همانندسازی بصورت خودمختار در درون میزبان داشته باشند.
• دارای جایگاه برش انحصاری برای آنزیم‌های محدودکننده  باشد.
• قطعه DNA ی insert شده نباید در خصوصیات همانندسازی وکتور تداخل ایجاد کند.
• باید دارای تعدادی marker gene جهت آنالیزهای بعدی باشد تا بتوان از این ژنهای مارکر برای شناسایی سلول‌های  recombinantاستفاده کرد ( معمولا ژنهای مقاوم به آنتی بیوتیکی که در سلول میزبان وجود ندارد).
• به راحتی از سلول میزبان قابل جداسازی باشند.

کشت سلول

• کشت سلول (Cell Culture) به فرایند کشت سلول های پروکاریوتی یا یوکاریوتی در یک محیط کشت، گفته می‌شود. این اصطلاح بیشتر در مورد کشت یاخته‌های جانداران چندسلولی کاربرد دارد. در این فرایند، یاخته‌ها در محیط آزمایشگاهی (in vitro) و تحت شرایط کنترل‌شده، رشد داده می‌شوند. شرایط کشت یاخته‌ای برای هر گونه از جانداران می‌تواند متفاوت باشد. محیط کشت، شامل ظرف کشت و ترکیب پایه (مثلا آگار) است.مواد مغذی (مانند اسیدهای آمینه، کربوهیدارت ها، ویتامین ها و مواد معدنی)، فاکتورهای رشد و هورمون ها به محیط کشت افزوده می‌شوند. از انکوباتور برای تنظیم جو محیط کشت (ترکیب گازهایی مانند دی اکسید کربن و اکسیژن)، فشار و دما در جهت بهینه‌سازی شرایط محیط کشت استفاده می‌شود. هم‌چنین اسیدیته و فشار اسمزی محیط نیز گاهی در فرایند کشت یاخته، با اهمیت تلقی می‌شوند. اکثر یاخته‌ها برای رشد، به یک سطح یا یک بستر مصنوعی (کِشت چسبنده یا تک‌لایه) نیاز دارند در حالی که برخی دیگر توان رشد به‌صورت شناور و آزاد در محیط کشت را دارند.