توضیحات

کارگاه بیان، استخراج و تخلیص پروتئین از میزبان باکتریایی

اجزا تشکیل دهنده وکتورها یا پلاسمیدها ی بیانی Multiple Cloning Site & Blue-White Screening

Multiple Cloning Site

کلونینگ DNA داخل یک وکتور شامل اتصال قطعه‌ای از DNA هدف به DNA وکتور می‌باشد. برای وارد کردن قطعه DNA درون پلاسمید از آنزیم های محدودکننده استفاده می شود. این آنزیم ها مولکول DNA را در توالی نوکلوتیدی خاصی قطع می‌کنند. به این توالی نوکلئوتیدی، جایگاه محدودکننده می گویند. گروهی از آنزیم های محدودکننده می توانند، انتهای چسبنده در انتهای قطعه DNA ایجاد کنند. این ویژگی آنزیم ها برای کلون کردن ژن درون پلاسمید استفاده می شود.

برای این کار قطعه DNA یی که قرار است وارد پلاسمید شود را طوری طراحی می کنند که در دو طرف توالی ژنی، جایگاه برش آنزیم قرار داشته باشد. همچنین پلاسمید را با همان آنزیم ها برش می دهند تا انتهای چسبنده مکمل قطعه DNA ایجاد شود. البته کاربرد انتهای چسبنده به تنهایی برای تولید DNA نوترکیب کفایت نمی‌کند چرا که پیوند بین نواحی تک رشته‌ای از نوع پیوند هیدروژنی  بین بازهای نیتروژنی DNA است و به اندازه‌ی کافی قوی نیست تا دو مولکول DNA را به همدیگر متصل نگاه دارد. برای رفع این مشکل باید پیوند کوالان فسفودی‌استر بین قطعات برقرار کرد که این عمل با به کاربردن آنزیم دیگری به نام آنزیم لیگاز مقدور می‌گردد.

برای آسان‌تر شدن کلونینگ، اغلب وکتورها دارای یک جایگاه به اسم جایگاه کلونینگ چندگانه یا (Multiple Cloning Site (MSC که جایگاه شناسایی چندین آنزیم محدود کننده می باشد. بنابراین می‌توان با انتخاب آنزیم محدودکننده مناسب کلونینگ را انجام داد.
MCSهای بسیاری از پلاسمیدها با توالی کد کننده lacZ همپوشانی دارند. در صورت کلون شدن ژن هدف در جایگاه کلونینگ اینگونه پلاسمیدها، ژن lacZ غیر فعال شده و با استفاده از غربالگری سفید-آبی می‌توان سلول های حاوی پلاسمید نوترکیب را تمیز داد.

Blue-White Screening

برای انتخاب کلونی هایی که پلاسمید حاوی توالی ژن نوترکیب هستند، روش غربالگری Blue-White Screening  بکار برده می شود. در این روش از اپران lacZ  که آنزیم بتاگالاکتوزیداز را بیان می کند، استفاده می شود. در صورت حضور ماده X-gal  در محیط، آنزیم بتاگالاکتوزیداز آن را به گالاکتوز و یک رنگدانه آبی نامحلول تجزیه می کند و در نتیجه کلونی های آبی رنگ تولید می شود. از این ویژگی اپران lacZ برای غربالگری کلونی هایی که پلاسمید نوترکیب را دریافت کرده اند، استفاده می کنند. در این روش جایگاه برش آنزیم محدودکننده درون اپران lacZ قرار دارد. درصورتیکه کلونینگ به درستی انجام گیرد، توالی ژنی مورد نظر درون این اپران قرار می گیرد و اپران غیرفعال می شود. درنتیجه آنزیم بتاگالاکتوزیداز تولید نمی شود و کلونی های حاصل از این سلول های حاوی پلاسمید نوترکیب، سفید خواهد بود.

وکتورهای کلونینگ

یک حامل یا وکتور کلونینگ قطعه ای از DNA است که از ویروس یا پلاسمید گرفته شده و می توان در آن یک قطعه DNA خارجی را طی فرایندی به نام کلونینگ وارد نمود. همانطور که گفته شد پلاسمیدها مولکول های DNA دورشته ای حلقوی به فرم سوپرکویل بوده که قابلیت همانندسازی مستقل از DNA باکتریایی را داشته و به طور پایدار به صورت خارج کروموزومی به سلول های دختری به ارث می رسند. فاژها، ویروس هایی هستند که به طور اختصاصی باکتری ها را آلوده می کنند.

فاژها مانند سایر ویروس ها ساختمان بسیار ساده ای دارند و فقط از یک مولکول DNA (یا گاهی اوقات RNA) تشکیل شده اند که چندین ژن، از جمله ژن هایی برای همانندسازی فاژ را حمل می کنند و توسط یک پوشش محافظ یا کپسید از جنس مولکول های پروتئین احاطه می شوند. باکتریوفاژهایی که بطور معمول برای کلونینگدر E.coli استفاده می شوند فاژها و M13 هستند.

خصوصیات وکتورهای کلونینگ

یک وکتور کلونینگ بطور معمول شامل:

۱- مبدا همانندسازی مستقل (Ori) است تا بتواند در داخل باکتری تکثیر یابد.

۲- حداقل یک مارکر انتخاب می باشد که توسط این مارکر می توان باکتری های دریافت کننده وکتور را از سایر باکتری ها تشخیص داد. اغلب مارکرهای انتخابی در باکتری ها، ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک هایی مثل کانامایسین، پنیسیلین و آمپی سیلین می باشند.

۳- مکان برش منحصر به فرد برای آنزیم های برشی محدودالاثر یا همان مکان کلونینگ برای وارد کردن DNA خارجی می باشد.

حضور مبدآ همانندسازی باکتریایی در یک وکتور ضروری است، زیرا لازم است تا از تکثیر در باکتری اطمینان حاصل شود. بسیاری از وکتورها حامل نقطه شروعی هستند که از پلاسمید CoIE1 در E.coli مشتق شده اند مانند pBR322-Ori یا pUC-Ori.

ین “وکتورهای با کپی بالا” میزان بالای تکثیرشان حتمی است زیرا همانندسازی آنها به کروموزوم باکتری وابسته نیست. مقاومت در برابر آنتی بیوتیک ها به منظور انتخاب باکتری های ترنسفورم شده استفاده می شود. همانطور که ذکر شد ژن های حامل مقاومت که اغلب مورد استفاده قرار می گیرند Amp و Kan هستند. ژن مقاومت به آمپی سیلین آنزیم B-لاکتام آمیدوهیدرولاز (B-لاکتاماز) را کد میکند، که آمپی سیلین و پنی سیلین را به اجزاء هضم شده بی اثر می شکند.

ژن مقاومت به آنتی بیوتیک

استفاده از آمپی سیلین برای انتخاب باکتری ترنسفورم شده، معمولاً روش کارآیی است. در روش دیگر، آنتی بیوتیک پایدارتر کاربنیسیلین” می تواند مورد استفاده قرار گیرد. ژن مقاومت به کانامایسین یک آنزیم فسفوریله کننده را کد میکند که کانامایسین – یک آنتی بیوتیک که در دماهای بالا بسیار پایدارتر از آمپی سیلین است – را غیر فعال میکند. این  آنتی بیوتیک حتی در برابر اتوکلاو شدن نیز مقاوم است. توجه کنید که غلظت های بیش از اندازه کانامایسین اثر انتخابی به شدت منفی دارد که می تواند رشد باکتری ترنسفورم شده را ضعیف یا مختل کند. همه وکتورها دارای تعداد معینی از جایگاه های شناسایی آنزیم های محدود کننده ای می باشند که توالی وکتور را تنها یکبار برش می دهند (برش دهنده های تک جایگاهی) تا کلونینگ یک قطعه DNA را میسر سازند. ممکن است یک وکتور حاوی بیش از ۲۵ جایگاه برش برای آنزیم های محدود کننده تک برشی باشند. در مورد باکتری اشریشیا کلای امروزه وکتورهای تجاری متعددی وجود دارد.

انواع سیستم های بیانی پروتیئن های نوترکیب

سلول های میزبانی که به منظور بیان پروتئین استفاده می‌شوند بسیار مختلف اند. هر کدام از این سیستم‌های بیانی، مزایا و معایب خاص خود را دارند. سیستم های پروکاریوتی  شامل باکتری های گرم منفی می باشند، و سیستم های یوکاریوتی شامل سویه های جدید مخمر، قارچ های رشته ای و سیستم هایی بر پایه گیاهان و حشرات که در سال های اخیر پیشرفت های چشمگیری داشته اند می باشند. حتی سیستم های آزمایشگاهی ابداع شده اند که عاری از سلول هستند و در محیط عاری از سلول در حالت درون آزمایشگاهی قادر به ترجمه پروتئین هدف می باشند. کیفیت پروتئین، عملکرد، سرعت تولید و بازده تولید، مهمترین عوامل در هنگام انتخاب سیستم بیان مناسب برای تولید پروتئین نوترکیب هستند.

هر سیستم بیانی دارای یک سری نقاط قوت و ضعف می باشد که می توان آن ها را به ویژگی هایی از لحاظ هزینه، سرعت، توانایی گلیکولیزاسیون و تا شدن پروتیئن، تقسیم بندی کرد. باکتری ها سریع ترین و ارزان ترین سیستم بیانی برای پروتیئن های نوترکیب می باشند. اما آن ها گلیکولیزاسیون پروتئین را انجام نمی دهند و یا پروتئین های پستانداران را به درستی  fold نمی کنند.

کشت های سلول های پستانداران، گلیکولیزاسیون و تا شدن پروتیئن رو به خوبی انجام می دهند اما نگهداری آن ها گران می باشد. بنابراین تعیین اینکه از چه سیسیتم بیانی برای پروتیئن نوترکیب استفاده کنیم بستگی به پروتئین و ویژگی های ذاتی خاص آن دارد.