48. کارگاه کاربری دستگاه الایزا

Description

کارگاه کاربری دستگاه الایزا

تست الایزا (ELISA) چیست|مراحل تکنیک الایزا

تست الایزا (ELISA) که مخفف (Enzyme-linked immunosorbent) میباشد، روشی برای تشخیص ایمنی و کشف بیماری های موجود در خون است. تست الایزا یک آزمایش ارزان و نسبتاً دقیق است و در آن یک نمونه خونی گرفته شده و در دور بالا سانتریفوژ می‌شود. پس از جداسازی سرم خون از ذرات٬ یک ماده معرف (کانژوگه) به سرم خون اضافه می‌شود که محلول را رنگی می‌کند و وجود پادتن‌های ضد ویروس موردنظر را مشخص می سازد. تست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار می برند. بدین ترتیب که یکی از این دو ماده در بستر جامد ثابت شده و برای ردیابی دومی بکار گرفته می شود.

مراحل تست الایزا

۱-  مرحله کوتینگ ( Coating):

شامل Coating آنتی ژن یا آنتی بادی اختصاصی در کف چاهک ها است که توسط کارخانه سازنده کیت انجام می شود.

۲- مرحله بلاکینگ (Blocking):

در این مرحله فضاهای خالی بین آنتی ژنها یا آنتی بادی های coat شده در کف چاهک، با یک پروتئین خنثی پر می شود. که توسط تولید کننده کیت انجام میگیرد. آلبومین سری گاوی از رایج‌ترین بلاک کننده ها می‌باشد.

۳- مرحله سمپلینگ (Sampeling):

این مرحله از تست الایزا سرم بیمار و یا معرف های دیگر نظیر استانداردها و کنترلها، درون چاهک ها ریخته می شود.

۴- انکوباسیون (Incubation):

انکوباسیون به معنای مدت زمان مشخص در درجه حرارت مشخص میباشد. معمولا در دمای ۲۵ یا ۳۷ درجه صورت می گیرد.
در این فرآیند آنتی ژن ها و آنتی بادی های موجود در چاهک ها با هم واکنش نشان دهند.

۵- اضافه کردن معرف نشاندار (Conjugate):

این مرحله معرف نشاندار شده با آنزیم که به کانژوگه معروف است به منظور نشاندار کردن واکنش های آنتی ژن و آنتی بادی افزوده می شود.

۶- شستشو چاهک ها (Washing):

در این مرحله با محلول شستشوی کیت، درون چاهک ها شستشو داده میشود. تا آنتی ژن ها و آنتی بادی های غیر اختصاصی که در واکنش شرکت نکرده اند و OD کاذب ایجاد میکنند، از محیط چاهک ها تخلیه شوند. این مرحله توسط دستگاه الایزا واشر صورت می پذیرد.

۷- اضافه کردن سوبسترا (TMB-Substrate):

در این مرحله از تست الایزا یک معرف دیگر به چاهک ها اضافه می شود که سوبسترا نام دارد. سوبسترا با کانژوگه واکنش نشان داده و سبب تشکیل رنگ درون چاهک ها می گردد.

۸- اضافه کردن محلول استاپ (Stop) :

در ادامه تست الایزا یک معرف دیگر به نام Stop به چاهک ها اضافه می شود. این معرف سبب متوقف کردن واکنش آنزیمی و در نتیجه جلوگیری از افزایش رنگ درون چاهک ها می گردد.

۹- مرحله خوانش (Read):

در این مرحله میزان جذب محتوای چاهک ها به کمک دستگاه الایزا ریدر در طول موج های مشخص اندازه گیری می شود.

چهار نوع اصلی الایزا وجود دارد:

روش های الایزا به چهار روش تقسیم می گردد: الایزای مستقیم، الایزای غیرمستقیم، الایزای ساندویچی و الایزای رقابتی. هر کدام مزایا، معایب و مناسبت منحصر به فردی دارند.

الایزا مستقیم (Direct ELISA)

یکی از روش های الایزا، الایزا مستقیم نام دارد. این روش وجود آنتی ژن را در نمونه تشخیص می دهد. یک چاهک میکروتیتر ابتدا با یک آنتی بادی همولوگ مخصوص آنتی ژن مورد نظر پوشیده می شود. پس از آن چاهک را با یک عامل مسدود کننده پوشش می دهند تا از اتصال غیر اختصاصی اجزاء جلوگیری شود. نمونه مورد سنجش به چاهک اضافه می شود. اگر آنتی ژن وجود داشته باشد، با آنتی بادی پوشش دهنده چاهک واکنش نشان می دهد. اگر هیچ کدام وجود نداشته باشد، هیچ واکنشی رخ نمی دهد. در این شکل از ELISA، آنتی بادی متصل به آنزیم (کونژوگه) نیز برای آنتی ژن مورد نظر اختصاصی است. هنگامی که به چاهک اضافه می شود، در صورت وجود به آنتی ژن متصل می شود. پس از زمان دادن به آنتی بادی مرتبط با آنزیم برای واکنش با آنتی ژن، چاهک شسته می شود تا هرگونه آنتی بادی متصل به آنزیم (که با اضافه شدن سوبسترا مثبت کاذب ایجاد می کند) حذف شود. پس از افزودن سوبسترا، تغییر رنگ شاهدی بر تبدیل آنزیمی سوبسترا به محصول آن است که نشان دهنده وجود آنتی ژن است.

الایزای غیر مستقیم (Indirect ELISA)

از دیگر روش های الایزا، تکنیک غیر مستقیم است که که از یک فرآیند دو مرحله ای برای تشخیص استفاده می کند، به موجب آن یک آنتی بادی اولیه مخصوص آنتی ژن به هدف متصل می شود و یک آنتی بادی ثانویه نشاندار شده علیه گونه میزبان آنتی بادی اولیه برای تشخیص به آنتی بادی اولیه متصل می شود. همانطور که برای سنجش مستقیم ELISA، آنتی ژن در سطح پلیت چند چاهکی بی حرکت می شود. این روش همچنین می تواند برای شناسایی آنتی بادی های خاص در نمونه سرم با جایگزینی سرم به جای آنتی بادی اولیه استفاده شود.

ساندویچ الایزا (Sandwich ELISA)

یکی از روش های الایزا، تکنیکی به عنوان الایزای رقابتی است. ساندویچ الایزا (یا ایمونواسی ساندویچ) رایج ترین فرمت مورد استفاده است. این فرمت به دو آنتی بادی خاص برای اپی توپ های مختلف آنتی ژن نیاز دارد. این دو آنتی بادی معمولاً به عنوان جفت آنتی بادی منطبق شناخته می شوند. یکی از آنتی بادی ها روی سطح پلیت چندچاهک پوشانده شده و به عنوان یک آنتی بادی جذب برای تسهیل بی حرکتی آنتی ژن استفاده می شود. آنتی بادی دیگر کونژوگه است و تشخیص آنتی ژن را تسهیل می کند. روش ساندویچ الایزا مرسوم ترین شیوه بین روش های الایزا محسوب می گردد. تصویر زیر یک گردش کار برای یک روش ELISA ساندویچ معمولی را نشان می دهد:

الایزای رقابتی (Competitive ELISA)

همچنین به عنوان ELISA مهاری یا ایمونواسی رقابتی شناخته می شود، سنجش های ELISA رقابتی غلظت یک آنتی ژن را با تشخیص تداخل سیگنال اندازه گیری می کنند. هر یک از قالب های قبلی را می توان با قالب رقابتی تطبیق داد. آنتی ژن نمونه برای اتصال به مقدار خاصی از آنتی بادی نشاندار شده با آنتی ژن مرجع رقابت می کند. آنتی ژن مرجع از قبل روی یک پلیت چندچاهک پوشانده شده و نمونه با آنتی بادی نشاندار شده از قبل انکوبه شده و به چاهکک ها اضافه می شود. بسته به مقدار آنتی ژن در نمونه، آنتی بادی های کم و بیش آزاد برای اتصال آنتی ژن مرجع در دسترس خواهند بود. این بدان معنی است که هر چه آنتی ژن در نمونه بیشتر باشد، آنتی ژن مرجع کمتری شناسایی می شود و سیگنال ضعیف تر می شود. برخی از کیت های رقابتی ELISA از آنتی ژن نشاندار به جای آنتی بادی نشاندار استفاده می کنند. آنتی ژن نشاندار شده و آنتی ژن نمونه (بدون برچسب) برای اتصال به آنتی بادی اولیه با هم رقابت می کنند. هرچه مقدار آنتی ژن در نمونه کمتر باشد، به دلیل آنتی ژن نشاندار بیشتر در چاهک، سیگنال قوی تر می شود.

مقایسه انواع روش های الایزا

انتخاب کیت ELISA مناسب برای نمونه مورد نظر

ارزیابی دقیق عملکرد آزمایش اولین گام مهم در انتخاب کیت ELISA جدید است. پارامترهای مهم شامل حساسیت، محدوده دینامیکی و دقت است که برای اکثر کیت های ELISA گزارش شده است. سایر پارامترها عملکرد ELISA را برای انواع نمونه معمولی پیش بینی می کنند. درصد بازیابی و خطی بودن رقت، پروتئین هدف را در نمونه های واقعی مانند پلاسما، سرم یا محیط کشت سلولی اندازه گیری می کند.

خلاصه پارامترهایی که باید هنگام انتخاب کیت الایزا به دنبال آنها باشید:

نکته مهم

برای بررسی مناسب بودن حساسیت و محدوده دینامیکی یک ELISA مشخص، مهم است که بدانیم چه سطحی از پروتئین مورد نظر در یک نمونه مورد انتظار است. نمونه هایی با غلظت بالایی از پروتئین هدف را می توان رقیق کرد تا سیگنال خام در محدوده دینامیکی مورد سنجش قرار گیرد.

حساسیت

حساسیت پایین ترین سطح پروتئینی است که جفت آنتی بادی مورد استفاده در کیت الایزا می تواند به دقت تشخیص دهد.

محدوده دینامیکی

محدوده دینامیکی به عنوان غلظت های بالا و پایین پروتئین هدف تعریف می شود که سنجش می تواند به دقت کمیت کند. مقادیر گزارش شده برای حساسیت و محدوده دینامیکی می تواند گمراه کننده باشد زیرا اغلب با استفاده از پروتئین استاندارد در بافرهای ساده تعیین می شود که ممکن است نشان دهنده سینتیک تشخیص یک پروتئین درون زا در یک نمونه بیولوژیکی نباشد.

CV

 CV (%) یا ضریب تنوع نشان می دهد که میزان سازگاری سنجش چقدر است. CV به طور کلی برای ارزیابی ثبات بین دقت inter-assay یا plate to plate و دقت intra-assay یا سازگاری بین تکرارهای اجرا شده در همان آزمایش محاسبه می‌شود. CVهای کمتر از ۱۵ درصد inter-assay عموماً قابل قبول هستند. درصد CVهای intra-assay باید کمتر از ۱۰ باشد.

اختصاصیت

مهم است که آنتی بادی های مورد استفاده در کیت ELISA با پروتئین های غیر هدف واکنش متقابل نداشته باشند. اینها می توانند پروتئین هایی با همسانی بالا در بین گونه ها باشند.

درصد بازیابی

درصد (%) بازیابی با متصل کردن مقدار مشخصی از پروتئین هدف خالص شده در یک نوع نمونه بیولوژیکی (همچنین به نام ماتریس نمونه) تعیین می‌شود. برای پروتئین های ترشح شده مانند سیتوکین ها، ماتریس های نمونه معمولی پلاسما و سرم هستند. برای پروتئین های داخل سلولی مانند کینازها، نمونه ها لیزات کشت سلولی هستند. نمونه متصل شده در الایزا اندازه گیری می شود و غلظت آن از منحنی استاندارد محاسبه می شود. این غلظت محاسبه شده با غلظت شناخته شده پروتئین مقایسه می شود و به صورت درصد بیان می شود. به عنوان مثال، بازیابی ۱۰۰٪ به این معنی است که غلظت مشاهده شده با غلظت واقعی پروتئین مشخص شده در نمونه یکسان بود. این نشان می‌دهد که پروتئین‌ها و سایر مولکول‌ها در نوع نمونه در تعیین کمیت پروتئین تداخلی نداشته‌اند. اگر درصد بازیابی کمتر از ۸۰ درصد برای یک نوع نمونه خاص باشد، باید یک کیت ELISA متفاوت برای تعیین کمیت انتخاب شود.

خطی بودن رقت

خطی بودن رقت همراه خوبی برای درصد بازیابی است، زیرا پروتئین اصلی را در نمونه های بیولوژیکی اندازه گیری می کند. خطی بودن رقت با اندازه گیری رقت های متعدد نمونه های مثبت شناخته شده توسط الایزا تعیین می شود. غلظت پروتئین هدف با ضرب ضریب رقت در غلظت محاسبه شده تعیین می شود. برای بهترین نتایج، غلظت نمونه ها باید برای همه رقت ها مشابه باشد. اگر اختلاف بیش از ۲۰ درصد از نمونه رقیق نشده مشاهده شد، باید یک کیت ELISA متفاوت برای تعیین کمیت دقیق انتخاب شود.

آماده سازی نمونه الایزا

این موارد دستورالعمل های کلی برای آماده سازی نمونه های آزمایش شده معمول برای استفاده در تست الایزا (آزمایش Elisa) هستند. مانند تمام جنبه های توسعه سنجش، روش های بهینه آماده سازی نمونه بسته به هدف و سنجش مورد علاقه متفاوت خواهد بود.

روش های آماده سازی نمونه

مایع رویی کشت سلولی

محیط کشت سلولی را در لوله سانتریفیوژ پیپت کرده و با سرعت ۱۵۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. بلافاصله از مایع رویی جدا کرده و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

عصاره سلولی

پلیت کشت بافت را روی یخ قرار دهید. محیط را آسپیره کنید و سلولها را یکبار با PBS سرد یخ بشویید. PBS را آسپیره کنید و ۰.۵ میلی لیتر بافر استخراج کامل را در هر پلیت ۱۰۰ میلی متری اضافه کنید. سلول ها را خراش دهید تا در پلیت کج شده جمع آوری شوند و در لوله از قبل سرد شده خارج شوند. برای مدت کوتاهی به صورت دورانی بچرخانید و به مدت ۱۵-۳۰ دقیقه روی یخ قرار دهید. با دور ۱۳۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید تا محتویات نامحلول ته نشین شوند. مقدار کمی مایع رویی (این عصاره سلولی محلول است) را به درون لوله های تمیز و سرد بریزید. نمونه ها در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

محیط شرطی شده

سلول ها را در محیط رشد کامل (حاوی سرم) قرار دهید و اجازه دهید سلول ها تا سطح تلاقی مطلوب تکثیر شوند. محیط رشد را بردارید و به آرامی با چند میلی لیتر PBS گرم بشویید. مرحله شستشو را تکرار کنید. آخرین شستشوی PBS را بردارید و به آرامی محیط رشد بدون سرم را اضافه کنید. ۱-۲ روز انکوبه کنید. محیط را داخل لوله سانتریفیوژ بریزید و با سرعت ۱۵۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. بلافاصله مایع رویی را جدا کنید و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

شیر

نمونه ها را جمع آوری کنید و در ۱۰۰۰۰ x g به مدت ۲ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را به مقدار کافی استفاده کنید و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

پلاسما

خون کامل را در لوله های حاوی ضد انعقاد جمع آوری کنید، و ۰.۱مولار سدیم را به حجم نهایی۱۰/۱ اضافه کنید. با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. بلافاصله مایع رویی (پلاسما) را به مقدار کافی تقسیم کنید و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

ادرار

نمونه ها را جمع آوری کنید و در ۱۰۰۰۰ x g به مدت ۲ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را به مقدار کافی استفاده کنید و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

بزاق

نمونه ها را جمع آوری کنید و در ۱۰۰۰۰ x g به مدت ۲ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را به مقدار کافی استفاده کنید و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

سرم

خون کامل را در لوله آزمایش ، به عنوان مثال، یک لوله بدون ضد انعقاد جمع آوری کنید. بدون مزاحمت در دمای اتاق به مدت ۲۰ دقیقه انکوباسیون کنید. با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. بلافاصله مایع رویی (سرم) را به مقدار کافی تقسیم کنید و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

عصاره بافت

بافت مورد نظر را با ابزار تمیز، ترجیحاً روی یخ و در اسرع وقت تشریح کنید تا از تخریب توسط پروتئازها جلوگیری شود. دستمال را در لوله های میکروفیوژ ته گرد قرار دهید و در نیتروژن مایع غوطه ور کنید تا به سرعت یخ بزند. نمونه ها را برای استفاده بعدی در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری کنید یا برای همگن شدن فوری روی یخ نگه دارید. برای یک قطعه ۵ میلی گرمی از بافت، ۳۰۰ میکرولیتر بافر استخراج کامل به لوله اضافه کنید و با هموژنایزر الکتریکی همگن کنید. تیغه را دو بار با استفاده از بافر استخراج کامل ۳۰۰ میکرولیتری برای هر شستشو بشویید، سپس به مدت ۲ ساعت در دمای ۴ درجه سانتیگراد هم زدن را ثابت نگه دارید (مثلاً روی شیکر اوربیتال در اتاق سرد قرار دهید). به مدت ۲۰ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کنید. روی یخ، مقدار کمی مایع رویی (این عصاره پروتئین محلول است) را در یک لوله تازه و خنک قرار دهید و نمونه ها را در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری کنید. چرخه های انجماد/ذوب را به حداقل برسانید.

نمونه کنترل های مورد نیاز برای روش های الیزا

کنترل‌های مناسب به شما کمک می‌کند تا نتایج مثبت واقعی را از نتایج نادرست تست الایزا (آزمایش Elisa) تفکیک نمایید. اگر زمانی نیاز به عیب یابی پروتکل خود داشته باشید، کنترل های مثبت و منفی نیز مفید خواهند بود.

کنترل مثبت

از یک نمونه محلول درون زا (endogenous) که حاوی پروتئینی است که شما شناسایی می کنید یا از یک پروتئین یا پپتید خالص شده که حاوی توالی ایمونوژن برای آنتی بادی مورد استفاده شما است استفاده کنید. یک نتیجه مثبت از کنترل مثبت، حتی اگر نمونه ها منفی باشند، نشان دهنده بهینه سازی و کارکرد درست روش است و بررسی می کند که هر گونه نتیجه منفی بدست آمده معتبر است. توصیه میشود برگه اطلاعات آنتی بادی را مطالعه کنید. اغلب یک کنترل مثبت پیشنهادی را ارائه می دهد. اگر کنترلی پیشنهاد نمی شود، موارد زیر را توصیه می کنیم:

• هر بافت، سلول یا لیزاتی که با موفقیت مورد استفاده قرار گرفته باشد می تواند یک کنترل مثبت مناسب در نظر گرفته شود.
• سعی کنید به پیوندهای پایگاه داده Swiss-Prot یا Omnigene در دیتاشیت نگاه کنید. این پایگاه‌های داده اغلب دارای فهرستی از بافت‌هایی هستند که پروتئین در آنها بیان می‌شود. اینها همچنین می‌توانند کنترل‌های مثبت مناسبی در نظر گرفته شوند.
• ورودی GeneCards را برای پروتئین بررسی کنید. زیرا معمولاً سطوح نسبی بیان را در بافت های مختلف برای شما فراهم می کند.
• اگر هنوز در یافتن یک کنترل مناسب مشکل دارید، توصیه می کنیم یک جستجوی سریع در PubMed انجام دهید تا ببینید کدام بافت ها و سلول ها پروتئین مورد نظر را بیان می کنند.

کنترل منفی

کنترل منفی نمونه ای است که می دانید پروتئینی را که شما تشخیص می دهید بیان نمی کند. کنترل منفی به منظور بررسی اتصالات غیر اختصاصی و مثبت کاذب است. هر پلیتی که استفاده می کنید باید حاوی یک نمونه کنترل منفی باشد تا نتایج را تایید کند.

استاندارد

نمونه ای است که حاوی غلظت مشخصی از پروتئین هدف است که منحنی استاندارد را می توان از آن به دست آورد. به عنوان مثال، در زیر یک منحنی استاندارد معمولی از کیت الایزا IL6 موشی با غلظت ۱۵.۶ تا ۵۰۰ میکروگرم در میلی لیتر آورده شده است. منحنی استاندارد ضعیف به این معنی است که آنتی بادی به درستی متصل نشده یا استاندارد پروتئین را نمی گیرد. مقدار R2 خط روند باید > 0.99 باشد.

استاندارد در کنترل ماتریس نمونه (کنترل اسپایک)

هنگام (آزمایش Elisa) نمونه های سرم در الایزا، طبق معمول یک استاندارد در بافر رقیق کننده معمولی قرار دهید. اما توصیه می کنیم یک استاندارد رقیق شده در سرم گونه ای که در حال آزمایش هستید نیز اضافه کنید. سپس می توان این دو را با هم مقایسه کرد تا اطمینان حاصل شود که هیچ تأثیری بر منحنی استاندارد سایر پروتئین های سرم وجود ندارد که به عنوان کنترل اسپایک شناخته می شود و به شما می گوید که یک پروتئین هدف پس از قرار گرفتن در ماتریس قابل بازیابی است. نتایج قابل قبول ۸۰-۱۲۰٪ است.

کنترل مثبت درون زا (Endogenous)

اگر در حال (آزمایش Elisa) یک نمونه پروتئین نوترکیب هستید، توصیه می‌کنیم که یک کنترل مثبت درون زا اضافه کنید که باید جزء ضروری آزمایش شما باشد. مشکلات طبیعی با تشخیص آنتی بادی پروتئین های نوترکیب وجود دارد که باید در نظر گرفته شود. تا شدن پروتئین نوترکیب ممکن است با شکل بومی درون زا متفاوت باشد و ممکن است از دسترسی آنتی بادی به اپی توپ جلوگیری کند به ویژه در مورد پروتئین های برچسب گذاری شده نیز صادق است. همیشه از قرار دادن برچسب ها در انتهای N یا C ترمینال پروتئین نوترکیب اطمینان حاصل کنید. مهمتر از همه، همیشه مطمئن شوید که پروتئین نوترکیب شامل توالی ایمونوژن آنتی بادی است که استفاده می کنید. یک کنترل مثبت درون زا برای تأیید نتایج مهم است، و همچنین نشان می دهد که واکنشگرها (مثلاً آنتی بادی ها) و روش چقدر خوب کار می کنند.